理学分子荧光光法

1、第一节概述 Generalization 第二节 基本原理 Principles 第三节 定量分析方法 Fluorometer 第四节 仪器与技术 Quantatitive Analysis 第五节 应用 Apply 第五章 分子荧光分析法 Molecular Fluorescence Analysis 第一节 概述 Generalization 一、光致发光 物质分子吸收一定能量的光后发射出的 光辐射。 荧光（Fluorescence) 持续时间：10 -9 10 -6 s 磷光（Phosphorescence) 持续时间：10 -3 10s 利用测量荧光强度而建立的物质含量分 析方法。 二

2、、荧光光度法 第二节 基本原理 Principles 一、分子荧光的发生过程 （一）分子的能级与电子能级的多重性 1. 分子的能级跃迁 每个分子具有严格分立的能级。 基态分子吸收了特征频率能量后，从低能 级向高能级跃迁，即处于不同的激发态。 hv Ei Ej E = E j Ei = hv 2. 分子的激发态 1 ）基态时，电子在各原子或分子轨道中成 对存在。在某一给定轨道中的两个电子 具有相反的自旋（自旋配对）。 2 ）所有电子自旋都配对的分子电子态叫基 态单重态（S 0 ) 基态单重态（S 0 ） 3) 处于基态单重态的电子对，其中一个电 子被激发到某一较高能级时，受激电子 的自旋仍然与处

3、于基态的电子配对，称 为激发单重态（S） 激发单重态（S） 4) 处于基态单重态的电子对，其中一个电 子被激发到某一较高能级时，两个电子 的自旋相互平行，称为激发三重态（T） 激发三重态（T） ? 激发单重态的平均寿命大约10 -8 s，而激发 三重态的平均寿命大10 -4 1s以上； ? 由基态单重态向激发三重态跃迁（S 0 T*) 属于禁阻跃迁，而由基态单重态跃迁到激发 单重态（ S 0 S*)是允许跃迁。 （二） 荧光和磷光的产生 - 最常见 去活化过程： 激发态分子在极短的时间内回到 基态的过程 。 无辐射跃迁 体系跨越 辐射跃迁 途径 1. 无辐射跃迁无辐射跃迁 振动驰豫 内转换 体

4、系跨越 外转换 振动驰豫 较高能级分子与其它分子（样品或溶剂） 碰撞，能量变为热能。 内转换和体系跨越 当两个相邻电子能级相距较近以致其振 动能级重叠，电子由较高电子能级以无辐射 跃迁方式至低一级电子能级，称为内转换。 电子由激发单重态向激发三重态（S 1 *T1*) 的无辐射跃迁称为体系跨越。 S 2 *S 1 * T2*T1* 内转换 体系跨越 S 1 *T1* 外转换 受激分子与溶剂或其它溶质分子间的相 互作用和能量转移。 外转换使分子的荧光或磷光减弱甚至消 失，这一现象称为“熄灭”或“淬灭”。 2. 辐射跃迁 - 荧光和磷光 处于电子激发态的分子（S 1 *或 T1 *）通过 光发射回

5、到电子基态，称为辐射跃迁。 S 1 * S 0 T1 * S 0 - 荧光 - 磷光 0 * 10 * 1 STSS EE ? ? 荧 磷 强度强度 F 磷 F 荧 讨论：讨论： 荧 = 10 -6 10 -9 s ， 磷 = 10 -4 x s 内转换 体系跨越 外转换 S 1 S 2 S 0 T1 吸收 1 吸收2荧光 3 磷光 4 无辐射跃迁 振动驰豫 固定测量波长 (选最大发射波长 ),化合 物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关 系曲线 （图中曲线I ） 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的 分子最多，荧光强度最大。 二、激发光谱与荧光光谱二、激发光谱与荧光光谱 1. 荧光(磷光

6、)的激发光谱曲线 测定荧光(磷光)强度的仪器装置示意图 固定激发光波长 (选最大激发波长), 化合物发射的荧光( 或磷光强度)与发射 光波长关系曲线(图 中曲线II或III)。 2.2.荧光光谱荧光光谱( (或磷光光谱或磷光光谱) ) 200260320380440500560 620 荧光激发光谱荧光激发光谱 荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱 3. 激发光谱与发射光谱的关系 （1）Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。 发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫 消耗了能量。 （2）发射光谱的形状与激发波长无

7、关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同 波长的能量（如能级图? 2 ,? 1 ），产生不同 吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振 动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧 光（如? 2 ）。 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与 激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 （3）镜像规则 镜像规则的解释： 基态上的各 振 动能级 分布 与 第一激 发态 上 的各振 动能 级分布类似。 基态上的零振动能级与第一激发态的二基态上的零振动能级与第一激发态的二 振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也 然。然。 200250300350400450500 荧光激发光谱荧光激发

8、光谱荧光发射光谱荧光发射光谱 nm 蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱 三、物质分子结构与荧光的关系三、物质分子结构与荧光的关系 （一）荧光效率（ f） 激发态分子中以发射荧光的光量子数目和 分子吸收激发光的光量子总数之比： 发射荧光的光量子数目 吸收激发光的光量子总数 f = f（0 ，1） 分子产生荧光必须具备的条件: （1）具有合适的结构（共轭刚性平面结构） （2）具有一定的荧光量子产率 ?激发态的分子有几种途径可以回到基态, 荧光去 激发比其它去激发快 ,才可以观 察到荧光发射。 ?荧光效率越大, 分子产生荧光的能力越大。 （二）分子结构与荧光 ? ? *的荧光效率高，系间跨

9、越 过程的速率常数小，有利于荧光的产生 。 1. 跃迁类型 提高共轭程度有利于增加荧光效率 并产生红移。 2. 长共轭效应 ? -?共轭程度 , f , 荧光强度， 。 当激发光波长为 ex 327nm 时，产生的 荧光为 em 510 nm 。 CH3 CH3 CH3 CH3 CH2OCOCH 3 CH3 维生素A 3. 分子的刚性和共平面性分子的刚性和共平面性 可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用， 故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结 构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。 共轭程度 荧光物质分子 刚性 共平面性 荧光效率 芳环上有推电子基，使荧光 。 4. 取代基效应 芳环上有吸电子

10、基，使荧光 。 推电子基: OH、 NH 2 、 NR 2 等 吸电子基: NO 2 、 COOH等 引入高原子序数原子（Br、I） 到 电 子体系，荧光减弱，磷光增强。 荧光强度对温度变化敏感，温度增加， 外转换去活的几率增加，荧光效率 。 (1) 温度的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、 配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。 (2) 溶剂的影响 极性，荧光。 重原子溶剂（CBr 4 、C2H5I），荧光 。 四、影响荧光的外界因素 弱酸或弱碱性化合物，溶液pH的影响较 大，需要严格控制。 (3) (3) 溶液的溶液的pHpH值值 NH3+NH2NH- OH- H+ OH- H+

11、 pH 13 无荧光 蓝色荧光 无荧光 与荧光物质分子发生相互作用引起荧光 熄灭的物质。 如：X-、重金属离子、O2、-NO 2 、 重氮化合物、-COOH、等。 (4) (4) 荧光熄灭剂荧光熄灭剂 自熄灭 待测物浓度过大时，会发生分子间碰 撞，使荧光强度减弱，称为自熄灭。 第三节 荧光定量分析 Quantatitive Analysis 一、基本原理 在稀溶液中，荧光强度 I f 有： I f = K c 二、定量分析方法 1. 工作曲线法 常将标准系列溶液中浓度最大的标准溶 液做基准，使其荧光强度读数为F0(100), 然 后测出其它溶液的相对荧光强度 以（I -I 0 ）对 C标作图，

12、测出I x ，查 （ I x -I 0 ）找对应 Cx。 C标Cx （I -I 0 ） （ I x -I 0 ） 2. 2. 标准对照法标准对照法 （ I s I 0）= K Cs （ I x I 0）= K Cx 0 0 II II sx s x cc ? ? ? 第四节 仪器与技术 Fluorometer 测量荧光的仪器主要由 四个部分组成：激 发光源、样品池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通 常成直角。 1. 激发光源 2. 单色器 光电荧光计常用干涉滤光片，荧光分光 光度计常用光栅。 特点：强度大、适用波长范围宽 常用：高压汞灯、氙弧灯、卤钨灯、 激光光源

13、仪 器 光 路 图 3. 样品池用石英材料，四面透明 4. 检测器光电池或光电倍增管 激发单色器：把不需要的光线滤去，让所选 择的激发光透过而照射在测定物质上。 选最大激发波长 ex 荧光单色器荧光单色器：把激发光所发生的反射光、溶 剂的散射光以及溶液杂质所产生的荧光滤去， 只让样品物质所产生的荧光通过而照射到检 测器上。 选最大荧光波长 em 可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧( (磷磷) )光光谱图光光谱图 第五节 应用 Apply 荧光法的优点： 灵敏度高、选择性好、取样量少等。 荧光法在临床检验、药物分析和生物化 学上应

14、用在不断扩大。如血液和组织液中极 微量的肾上腺素、组胺、多巴胺、5-羟色胺 和胆碱的测定，均可用荧光法达到目的。 一、直接荧光测定法 色胺的含量是色胺酸新陈代谢的一个标 志。色胺有天然荧光，激发峰为285nm，荧 光峰为 360nm 。利用苯可从尿或组织液中 萃取出来， 即可进行检测。在0.1 8 g / 15mL 范围内，F与色胺浓度呈线性关系。 基于药物本身受特定波长光激发后能产 生荧光。 例如： 二二 、化学引导荧光测定法、化学引导荧光测定法 自身化学结构 不 产 生 荧 光 化学处理 产物的化学结 构 具 有 荧 光 结构变化 增加电子共轭程度 增加分子结构刚性和共平面性 1. 氧化还

15、原反应 血浆中苯妥英的测定 血浆中苯妥英二氯乙烷萃取 NaOH溶液 KMnO 4 氧化正己烷萃取 浓H2SO 4溶液 回提 二苯酮 N H N H O O H5C6 H5C6 C H5C6 H5C6 O KMnO4 OH - 2. 水解反应水解反应 血清中氨苄青霉素的测定 CH NH2 CNH N O S CH3 CH3 COOH O H+ H2O,HCHO CH NH NH R O O 3. 缩合反应 血清中异味烟肼的测定 N H CH2CH2NH2 HCHO N H N N H NH H2O2 4. 络合反应络合反应 药物与金属离子发生络合反应，形成具 有荧光的分子。 5. 光化学反应 药

16、物发生光催化反应，形成具有荧光的 分子。 N CN C CH2 Cl NHCH3 N H CN C CH2 Cl O N H CN C CH2 Cl O O pH4.8 沸水浴 日光 6. H 2 SO 4 引导荧光 甾体化合物在浓H2SO 4 作用下可因质子化 而产生荧光。 三、制备荧光衍生物测定法 1. 与荧光试剂反应生成荧光衍生物 2. 胺荧与含伯胺、仲胺或潜在胺基的 药物作用产生荧光 3. 与单酰氯反应生成荧光衍生物 4. 与邻苯二甲醛反应生成荧光衍生物 5. 与荧光染料反应生成荧光离子对 四、淬灭荧光测定法四、淬灭荧光测定法 药物与荧光试剂反应，生成的产物能淬 灭荧光试剂的荧光，与试剂空白比较降低了 荧光强度，测定样品液荧光强度减弱的定量 方法。方法。 五、化学发光免疫分析法五、化学发光免疫分析法 特点：高灵敏度、免疫分析专一性； 超微量分析； 分析浓度10 -12 10 -15 mol.L -1 ； 具有比放射性同位素法安全。 抗原或 抗体 标记 + 酶或荧光化合物 荧光 在抗原上或抗体上标记活性物质（酶或 荧光化合物），通过测定荧光来确定标记抗 原抗体结合率进行药物定量的方法。 P- 酶 P- 荧光物 H2O2 1. 荧光免疫分析法（FIA） 标记活性物质：鲁米诺及其衍生物、焦棓酸等 氨基酸 + O 2 ? 酮酸 +NH