产漆酶真菌以及漆酶的分析研究

1、产漆酶真菌以及漆酶的研究摘要：漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在细菌、真菌、放线菌、植物中都有报 道，但报道最多的为真菌，尤其是白腐真菌。漆酶能够降解环境中的木质素， 在纸浆漂白、废水处理中意义重大。漆酶通常情况下漆酶含有4个铜原子结合位点，通过电子在这四个铜原子间相互传递达到分解底物的目的。漆酶基因的异 源表达已经吸引了广大学者的目光，至今为止，数十种真菌的漆酶基因已经成 功在酵母等异源表达系统中表达，我们可以预见漆酶在人类未来的生活中将发 挥重要作用。关键词 ：漆酶，白腐真菌，铜原子结合，异源表达现如今，环境污染已严重影响了人类的生存，造纸厂、纺织厂排出的废水 则是重要的污染源之一。木质素是使

2、废水颜色发黑的主要原因1，倘若在工厂排出废水前先将木质素出去，将会大大降低废水的毒性。木质素是由聚合的芳 香醇构成的一类物质，存在于木质组织中，是世界上仅次于纤维素的第二位最 丰富的有机物。木质素作为纤维素的粘合剂，能增强植物体的机械强度，利于 输导组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭。木质素外观上是一种白色或 接近无色的物质，相对密度大约在 1.351.50 之间，非常坚硬，难溶于各种无机 或有机溶剂 2。木质素属天然芳香族高分子聚合物，是一类在自然界存在量很 大但是又较难降解的可再生资源，木质素不含易水解的重复单元，因而不受水 解酶的攻击，不仅如此，它还和半纤维素以共价键形式结合，将纤维

3、素分子包 埋在其中，形成一种天然屏障，使纤维素酶不易与纤维素分子接触，给纤维素 的降解也造成了困难 3。因此去木质素成为目前人们面临的一大难题。1 白腐真菌降解木质素 研究表明，在自然界中，木质素的完全降解是真菌、细菌、放线菌及相应 微生物群落共同作用的结果。其中，真菌起主导作用 4，某些真菌能够有效的 降解木质素，尤其是白腐真菌vwhite-rot fungus）可通过一系列的酶促反应实现 对木质素的彻底降解。白腐真菌是一类丝状真菌，分类学上属于真菌门，绝大 多数为担子菌纲，少数为子囊菌纲。目前，研究最多的是黄孢原毛平革菌、彩 绒草盖菌、变色栓菌、射脉菌、凤尾菇等。其中，黄孢原毛平革菌是典型

4、菌 种，是研究木质素降解的模式菌，普遍分布于北美，我国尚未发现。白腐真菌木质素酶系统包括两类三种 ，一类是是能利用H2O2作电子受体 的过氧化物酶类，这类酶包括木质素过氧化物酶 （EC 1.11.1.13 Lignin Peroxidase, 简称Lip和锰依赖过氧化物酶（EC1.11.1.14 ManganesePeroxidase简称MnP ；另 一类是利用02作为电子受体的多酚氧化酶类，这类酶称为漆酶 （EC 1.10.3.2laccase简称Lac。以上三种酶各自代表一系列同工酶。木质素过氧化 物酶和锰依赖过氧化物酶都是含亚铁血红素的糖蛋白，木质素过氧化物酶分子 量大约为40 kD,锰

5、依赖过氧化物酶的分子量一般在 3862.5 kD之间，它们的血 红素辅基埋在蛋白质内构成活性中心 （锰依赖过氧化物酶的活性中心尚需一个 Mn2+和两个起稳定结构作用的Ca2+;漆酶则是一种以O2作电子受体的含有4个 铜离子的氧化酶，分子量在 6080 kD 之间。2 漆酶催化氧化底物的基理漆酶最早由一名日本人发现，它并非只存在于微生物界，在细菌、植物中 也有报道 5。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶 6，属于蓝色多铜氧化酶家族，能够 氧化多种芳香化合物和其它有机化合物，且副产物只有水，被誉为“绿色 酶”。漆酶一般以单体存在，极少情况下会有同源或异源二聚体，以及同源四聚 体。通常情况下漆酶含有 4个铜

6、原子结合位点，根据其光谱和磁性特征可将其分 为三类，1型Cu2+一个，呈蓝色，在紫外可见光谱614 nm处有特征吸收，U型 Cu2+一个，非蓝色，没有特征吸收光谱，川型 CU24+两个，是耦合的离子对，在 紫外可见光谱330 nm处有较宽的吸收带。在三类铜原子中，前两种是单电子受 体，顺磁性，可用顺磁共振测定，川型 Cu24+是反磁性，无法用顺次共振检测。 I型Cu2+中心相对独立，并且都与两个组氨酸His ）的N和一个半胱氨酸 3+，并失去一分子 水，1型Cu+和川型Cu22+由一价变成二价。U型Cu+再氧化很慢，氧中间体一 直与川型CU22+相连，当它从U型Cu+接受第四个电子还原为水时才

7、脱离川型 Cu24+，这时四个铜离子都是二价，漆酶呈氧化态。这样，通过四个铜离子的协 同作用，传递电子，同时发生价态变化，实现漆酶对底物的催化氧化。3漆酶的异源表达虽然漆酶的潜在应用价值很广 ，比如在纸张漂白、生物修复、染料脱色、 果汁与酒的澄清和纺织品的清洁等，但是由于产量低，价格昂贵，漆酶的工业 应用受到很大的限制。漆酶属于真菌的第二产物，仅在外界环境恶劣的情况下 才会诱导产生，因此仅凭野生菌生产的漆酶远远无法满足需求。异源表达漆酶 基因是个有效的办法，目前已有多种蛋白通过异源表达的方法投入工业生产， 比如青霉素、蔗糖酶、几种生长激素等。漆酶异源表达的前提是将其基因克隆出来910，1988

8、年Frohman等首次利用 快速扩增cDNA技术从白腐菌P ostreatus中克隆到漆酶poxI基因，后来的学者多用RT- PCF技术来获得漆酶基因；也有学者先建立菌种的 cDNA文库，然后以已 知的漆酶基因做探针进行筛选；还有人利用漆酶铜原子结合位点的保守性，设 计引物克隆漆酶基因。到现在，30种不同来源的漆酶基因已被克隆和测序。酵母表达系统是目前研究的较为透彻的表达系统，它易于进行分子遗传操 作，能够对重组蛋白进行翻译后的加工修饰和分泌表达，具备完善的发酵方 法，重组蛋白表达量高，自身满足安全需要，已成功生产了多种重组蛋白。酵 母也成为重组漆酶的主要表达宿主，Trametes sangu

9、inea、Trametes versicolor、MelanocarpusAlbomyces、M. thermophila、Pleurotus ostreatus、TrametesVersicolo等产漆酶的菌株的重组基因均被报道在酵母 S. cerevisiae中表 达。外源漆酶基因在酵母中表达会受很多因素影响，如启动子、信号肽、漆酶 基因、表达菌株型号和发酵条件等。有报道表明在S. cerevisiae表达漆酶时采用诱导型启动子比组成型启动子能获得更高的表达量，采用a因子信号肽一般比漆酶本地信号肽得到更好的表达效果；另外，发酵方式、温度、pH值等对表达影响很大。其次，丝状真菌表达系统是另一

10、种用于生产重组蛋白质产品的工 具，其优势在于其具有分泌大量胞外蛋白质的能力。目前，真菌漆酶已在黑曲 霉（A. niger、构巢曲霉（A. nidulans、M 曲霉（A. oryzae、里氏木霉（T. reese 中进行了异源表达的研究，最高表达量可达 7000 U /L。但与酵母表达系统相 比，酶活相对较低，为了提高漆酶的表达量，研究者对丝状真菌表达系统进行 了改进，比如选择来源于丝状真菌自身的强启动子构建表达载体，通过构建融 合蛋白提高漆酶的分泌水平，或抑制丝状真菌自身的蛋白酶系统，以降低对异 源漆酶蛋白的水解等等。4 结论 生物降解木质素是一种趋势，利用生物方法漂白纸浆、处理废水、去除木

11、质 素不仅污染小，而且使用效率高，能耗低，虽然其效率受诸多因素的影响，随 着科技的发展，人类对木质素降解机制的认识越来越清楚，我们有理由相信， 漆酶的研究和应用将取得重大进步。参考文献1 Deepak Pant AE Alok Adholeya.Concentration of fungal ligninolytic enzymes by ultrafiltrationand their use in distillery effluent decolorizationJ.World J Microbiol Biotech nol ,2009, 25:1793-800.2 王红.论白腐真菌产木质素降解酶在环境治理中的应用J.现代商贸工业，2009,7 :297-298.3 王华,刘小刚，罗华，杨光.木质素降解菌筛选及葡萄枝条木质素降解研究J.西北农业学报 ,2009 ,18 (5 :302-305.4 张力,韩大勇 . 白腐真菌木质素降解酶系研究进展 J .中国牧业通讯， 2008， 23：6-8.5 曾涛,陈汉清 ,曾会.木质素酶及其生产菌的筛选育种 J. 基因组学与应用生物 学，2009,28(3, 578-582.宋安东,王艳婕，王松江，戚元成，吴坤.漆酶的分子生物学研究及其应用J.信阳 师范学院学报 , 2004,1