蛋白激酶PLK1的分子动力学模拟和药物设计、核受体PXR分子对接的研究（可编辑）

1、蛋白激酶plk1的分子动力学模拟和药物设计、核受体pxr分子对接的研究 中国科学院上海药物研究所 博士学位论文 蛋白激酶plk1的分子动力学模拟和药物设计、核受体pxr的分子 对接研究 姓名：刘治国 申请学位级别：博士 专业：药物设计学 指导教师：陈凯先;沈建华 20060601 摘 要 摘 要 保罗样激酶 polo-1ikekinase，简称plk 是一个与细胞周期的调控紧密 相关的丝氨酸苏氨酸激酶家族，在有丝分裂 mitosis 的各个时期以及细胞 周期检测点响应中发挥重要的作用。在plk的各家族成员中，plkl的异常表达 常常与肿瘤形成相关，并已经在多种类型的癌症中被检测到。因此，研究p

2、lkl 的分子生物学和调节功能有助于揭示plkl在细胞周期调节中扮演的角色以及它 的激活与肿瘤形成之间的关系。论文的第一章综述了plkl的分子生物学研究进 展，包括plkl在细胞周期中的作用、结构域以及相应的功能、与癌症的关系、 在药物开发中的价值以及目前在抑制剂开发研究中的一些进展。由于它在有丝 分裂调节中的特定角色，plkl被认为是一个癌症治疗的潜在靶标。 生物化学研究发现，在plkl的激酶结构域和保罗盒结构域之间存在着一种 分子内抑制作用，它对于plkl的激酶活性调节有着重要的意义。同时，在激酶 结构域上thr210的磷酸化或者一段磷酸化小肽与pbd的结合都能解除这种抑制 作用。基于这种

3、现象，有人提出了一种plkl的调节机理假说，认为磷酸化小肽 与pbd的结合在kd-pbd的结合界面上诱导产生了某种未知的构象变化，从而导 致plkl的分子内相互作用被破坏。为了探讨kd和pbd的动力学性质及其对分 子内的活性调节的影响，我们利用各种计算方法包括同源模建、蛋白质蛋白质 对接、分子动力学和构象主成分分析等，深入研究了plkl的分子内调节机理。 这部分内容在论文第二章进行了详细的描述。动力学模拟结果显示，kd和pbd 都分别拥有两种状态。在thr210上的磷酸化使kd稳定在关闭的状态，而未磷 酸化的kd在激活槽区是打开的，而只有未磷酸化的kd能与pbd结合。pbd则在 两种不同的构象

4、之间互相变换，这两种构象的主要区别在于pbl和pb2的相对 取向不同，分别对应于pbd的打开和关闭状态。同时，我们还观察到磷酸化小 肽与pbd的结合能够中断这种开合运动，使pbd的构象锁定在关闭状态。蛋白 质一蛋白质对接结果揭示了打开状态的kd和关闭状态的pbd以一种相当有趣的 中国科学院上海药物研究所博士学位论文 vi 摘 要 结合口袋则被kd的一段螺旋qc所占据，形成一个所谓的“双向咬合”的结合 模式。这种结合模式较好地解释了pbd对kd的激酶活性抑制现象，以及磷酸化 小肽如何破坏这种分子内的相互作用。基于我们的模拟结果和分析，我们提出 了一种原子水平上的kdpbd之间的分子内调节机理。首

5、先，kd的磷酸化状态决 定了它有两种不同的构象，thr210磷酸化时，kd的构象是关闭并且活性的；在 的状态，分别对应关闭状态和打开状态。磷酸化小肽的结合能够将pbd稳定在 关闭的状态。第三，打开状态的kd与关闭状态的pbd结合，从而抑制激酶的催 化活性和pbd的磷酸化小肽结合能力。该研究在原子水平上为揭示plkl的分子 内调节机理提供了一些有意义的线索和结论。分子动力学模拟清晰地描述了kd 和pbd在各种不同条件下的动态特征。大量的实验现象验证了我们的kd-pbd结 合模型，反过来肯定了我们模拟手段的正确性。该研究可能有助于指导新颖的 plkl抑制剂的发现与设计。 近年来陆续有一些plkl的

6、激酶抑制剂被发现，这些抑制剂中的大多数对 plkl的激酶活性显示出较强的抑制能力。但是，由于atp结合口袋的高度保守性， 这些抑制剂对plkl的选择性普遍较差。寻找作用于其它位点的抑制剂应该可以 改善抑制剂的选择性。在论文的第三章，我们以pbd的晶体结构为基础，建立了 两个虚拟筛选模型，分别对specs和acd两个化合物库进行搜索，以发现新型的 plkl抑制剂。后处理程序包括一致性打分，类药性评价，药物化学家的建议等 等，都被用来对候选化合物进行精简。最后对specs和acd库分别购买了大约65 和32个化合物。生物活性测试表明有超过七个候选化合物可以与pbd结合，其 结合常数 6 均在um级

7、别。在这些候选化合物中，有一个化合物可以在细胞 水平有效抑制小鼠白血病细胞p388的生长，其抑制的罐为333um。这个结 果是十分令人振奋的，对于将来的抗白血病药物开发可能具有指导意义。 中国科学院卜海药物研究所博士学位论文 摘 要 v11 人类孕甾核受体是配体激活转录因子核受体家族成员之一，它是哺乳动物 因表达的化合物所激活，并且它的激活与许多不利的药物一药物相互作用紧密相 关。为了研究pxr配体结合位点上对于激活至关重要的结构特征，我们利用pxr 的四个晶体结构，对30多个结构不同的pxr激动剂和拮抗剂进行了一系列分子 对接研究。研究结果在论文的第四章进行了详细讨论。基于这些对接结果，我

8、们确定了pxr结合口袋内对于激活比较关键的一些残基，讨论了这个口袋能够 容纳各种结构不同的小分子配体的原因。此外，对于类固醇类衍生物的激动剂， 我们在一定程度上获得了预测结合自由能与生物活性之间的相关性，说明我们 的对接方法比较适合pxr体系，能够反映出它的结构与功能之间的关系。许多 突变实验证实了我们的模拟结果，因而将来有可能被用来建立一个药物一药物相 互作用的评价模型。 关键词：plkl，分子动力学模拟，同源模建，蛋白质一蛋白质对接，主成分分 析，虚拟筛选，抑制剂，pxr，分子对接 中国科学院上海药物研究所博士学位论文 abstract ix _-一一 abstract related t

9、othe ofserinethreoninekinases polo1ike family kinases plks belong in roles all ofmitosisand tothe ofcell duringstages cycle，whichplaykey regulation of themembers cell to stress。among plks， the checkpointresponsegenotoxic cycle been ofplklis associatedwith andhas deregulatedexpression closely oncogen

10、esis ofthemolecularand in of biology detected cancersthus，investigation manytypes for theroleofplk1 inthe ofplk1 iscrucial function understanding regulation molecular correlationwith biology ofcell andthe oncogenesisthe cycle regulation incell the therole in iof cycle， plk1 wasreviewed thesis，includ

11、ing of chapter with associationcancer,the andtheir functions，the structuraldomains corresponding thecurrent inthe ofinhibitors for discovery value proceeding development，and drug of hasbeen to becauseofits roleinthe mitosis，plklsuggested specific regulation a forcancer be target therapy potential th

12、ekinase inhibitionbetween existsanintramolecular interestingly,there plk is inthe the 1，whichimplicated domain kd anddomain pbd of polo。box onthr210ofthe ofitskinase phosphorylation regulation activitymeanwhile，one ofa withpbdissufficientto ortheassociation kinasedomain phosphopeptide onthese has in

13、hibitionbaseobservations，ahypothesis relievetheintramolecular unknown asthatthe inducessome been binding proposed phosphopeptide onthekdpbd the transition interface，therebyinterrupting confbnnational kd interactionto intothe ofboth intramolecular gaininsight dynamicalproperties the levelsand some fo

14、r design，we pbdattheatomic drug and provideguidelines mechanismofplk1 with studiedtheintramolecular regulation methods modeling，proteinprotein includinghomology is in ii chapter and analysisthistopicpresented component dynamicsprinciple two kdis andpbd statesthe resuitsshowthatbothkd possess phospho

15、rylated kd be statewhereasthe mayremarkably stabilizedattheclose unphosphorylated pbdis with to clefttheisolated respect totheactivation dynamic openedregarding 一一一 中国科学院上海药物研究所博士学位论文 x abstract therelativeorientationofpb1 and alsoobservedthatsuch pb2meanwhile，we be ofthe motioncan the open-and-clos

16、e disruptedby binding resultrevealsan modebetweenthe proteinproteindocking interestingbinding open statekd the state whichthe the and close pbdin entranceof activationcleftofkd holdsl2linkerof theentranceofthe of pbd，while phosphopeptidebindinggroove pbd kdthis clutchesthehelixcof modewell boththein

17、hibition binding explains ofkinase pbdandthe ofthe activityby phosphopeptide-induced disruption and intramolecularinteractionbasedonour simulationresultsand modeling anatomicmechanismfortheintramolecular analyses，weproposed regulation betweenkdandpbdofplk conformationoffreekdisdetermined 1 i the by

18、its conformationiscloseand state；whenphosphorylated，the active； phosphorylation when is and pbdalso two unphosphorylated，itopen inactive ii freepossesses differentstatestheclosestateandthe statethe isable binding open phosphopeptide kd withthe tostabilizepbdintheclose inactiveform associate state ii

19、i the closeform the ofthe catalyticactivity kinasebycontrast，the pbd，decreasing otherthe activeformkdorthe statepbdisunabletobindtoeach open present has anew intotheintramolecularmechanismof studyprovidedinsight regulation addressedthe plklattheatomiclevelthemdsimulations clearly dynamics kdandpbdun

20、derdifferentconditionsthemodeofkdwith behaviorof binding pbdiscorroboratedabundant inturn observations，which by experimental vindicatesour to the and of helpguidediscoverydesign modelingprotoc01itmay 1 inhibitors hovelplk havebeenfound recent ofthese afewplk1 inhibitors during yearsmost inhibitors i

21、nhibitiontothekinase ofplk potent activity display show forplki fromotherkinasesduetothe inhibitors selectivity highly poor conserved tosomesitesotherfromthe atpbindingcavitytargeting to the ofinhibitorsin is iii，we supposedimprovespecificity chapter pocket topbdwetwo theresultsofourvirtual built de

22、monstrated screeningtargeting models onthe structureof searchedthe virtual based crystal pbd，and screening 中国科学院k海药物研究所博士学位论文 abstract specsandacd librariesto discovernovelplkllnhibitors compound consensus evaluationand analysesincluding scoring，drug-likeness postprocessing medicinal are torefinethe

23、candidatelistaround65 chemistsproposalsemployed and32 were forspecsandacd compoundspurchased intotalweredeterminedtobindtopbdwithvalues morethansevencandidates kd at these wasfoundtoinhibitthe micromolar levelamongcandidates，onecompound of micromolarthisresultis ofp388leukemiacelllinewithanic50333 g

24、rowth willbenefitforfurther ofanti-cancer and drugs veryimpressive development human x memberofthenuclear receptor hpxr ，a receptorfamily pregnane of a of p4503a factors，isregulatorcytochrome ligandactivatedtranscription key inmammalianliverandsmallintestinepxrisactivatedmostof geneexpression by the

25、xenobioticsthatinducecyp3a4 itsactivationis geneexpression，and closely relatedto adverse interactionstothe features many drug-drug investigatebinding crucialfortheactivationof carriedouta seriesofmolecular pxr，we docking four structuresforaround30 diverse onthe pxr structurally experiments crystal r

26、esultswere in ivbasedonthe results，a chapter docking compoundsthepresented activationofhpxrwere fewresiduesinthe crucialforthe ligandbindingpocket reasonthis couldaccommodate diverse identifiedthe structurally why pocket the free isdiscussedin correlationbetween ligands addition，a predictedbinding t

27、hesteroid andthe wasderivedfor analoguesthedocking energy biologicalactivity resultswerecorroboratedmutation andcouldbe for bymany experiments helpful anevaluationmodelonthe interaction developing drugdrug potency keywords：plkl，moleculardynamicssimulation，homologymodeling， proteinproteindocking，prin

28、cipalcomponentanalysis，virtual pxr，docking 中国科学院上海药物研究所博士学位论文 第一章plki激酶的分子生物学和研究进展 第一章plkl激酶的分子生物学和研究进展 11引言 从上世纪初开始，癌症逐渐成为世界上威胁人类健康的重大疾病之一。随 着分子生物学与细胞生物学的发展，各种与致癌相关的靶基因陆续被发现。相 应地，与癌症相关的控制细胞分裂与增殖的分子机制也得到了广泛的研究。这 些研究发现细胞周期受到一系列不同的激酶的调控。其中，保罗样激酶家族 plk 由于其自身的特点受到越来越多的关注。该家族最早被发现的成员是果 蝇的polo蛋白n?引，这是一个丝氨

29、酸苏氨酸激酶。而哺乳动物的四个plk家族成 陆续被发现阳侧。大量研究显示plk激酶在有丝分裂过程中行使多种功能，并且 对于有丝分裂检测点的调节也起着重要的作用。 plk激酶家族中研究得最为透彻的成员是plkl。研究发现该激酶的活性以及 细胞浓度对于细胞分裂的精确调控至关重要n。121。plkl在各种癌细胞系中都过 量表达，而且它的表达往往和不良的病人预后相关n31。此外，plkl还和肿痛的 发生密切相关，属于能被各种药物直接作用的疾病相关蛋白激酶家族之一。因 此，它的发现为药物化学家们提供了一个极具前景的开发抗癌药物的新靶点。 12plkl的细胞生物学 在m期达到顶峰陌，14。1刚。早期在酵母菌中的遗传学研究显示，polo的突变体表现 出纺锤丝缺陷和各种有丝分裂异常，说明plk激酶可能在m期参与了众多的有丝 分裂功能n7侧 图1-1 。plkl在哺乳动物中的基本功能是控制有丝分裂的进程， 尤其是调节那些与中期一后期过渡以及有丝分裂结束相关的蛋白。一些研究显示 plkl的缺失会导致中期阻滞和哑铃状染色质结构的形成，但是并不会诱导g2期 阻滞n卿刳。 中国科学院上海药物研究所博士学位论文 蛋口撒瞰plki的分r动力学模拟和药物世计、核受体pxr的分，对接研究 大量的研究证实plkl是一个开发治疗增殖相关疾病如癌症的可能靶标