细胞沉默调节蛋白1(sirt1)活性荧光定量检测试剂盒（中文版

1、 细胞沉默调节蛋白1 （sirt1）活性荧光定量检测试剂盒（中文版）主要用途 细胞沉默调节蛋白1 （sirt1）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针氨甲基香豆素标记人工合成的乙酰化p53多肽底物，经过sirt1脱乙酰基后，被位点特异性氨基肽酶水解，释放黄色对硝基苯胺，即采用荧光法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、核蛋白样品、部分或完全纯化酶样品中sirt1的活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。技术背景人体组蛋白脱乙酰基酶（histone d

2、eacetylase；hdac）家属分成三类共20多个蛋白：种类i（class i）与酵母rpd3蛋白同源，包括hdac1、2、3、8，存在于细胞核中；种类ii（class ii）与酵母hda1蛋白同源，包括hdac4、5、6、7、9a、9b、10和hdrp/mitr，存在于细胞核和细胞浆里；上述两大种类的蛋白分子催化结构域含有锌，且曲古菌素a（trichostatin a；tsa）敏感。种类iii（class iii）为nad+辅助因子必需，又称为sirtuins，与酵母sir2（silent information regulator 2）同源，包括sirt1至7等，为曲古菌素a（tric

3、hostatin a；tsa）不敏感型赖氨酸脱乙酰基酶（lysyl-deacetylase）。催化赖氨酸脱乙酰基反应，以及由nad+和乙酰（acetyl）基团转化产生的烟酰胺（nicotinamide）和o-乙酰adp核糖（o-acetyl-adp-ribose）。sirt1位于细胞核内，与酵母sir2同源性最高。其功能在于调节p53活性和抑制细胞凋亡。基于人工合成的乙酰化p53（379至382氨基酸位点）多肽底物ac-arghis-lys-lys（ac）具有抗氨基肽酶切离的功能，首先使用荧光染料氨甲基香豆素（aminomethylcoumarin；amc）来标记乙酰化p53多肽底物，其次进行

4、脱乙酰化，最后底物进一步在氨基肽酶的催化酶解，释放出具有强烈荧光的7-氨-4甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin；amc）（激发波长350-360nm；散发波长450-465nm），由此来定量测定沉默调节蛋白1的活性。其反应系统为：产品内容 裂解液（reagent a） 毫升 分离液（reagent b） 毫升 清理液（reagent c） 毫升 萃取液（reagent d） 毫升 缓冲液（reagent e） 毫升 底物液（reagent f） 微升 终止液（reagent g） 微升 酶解液（reagent h） 微升 补充液（reagent i） 微升 标准液（r

5、eagent j） 微升产品说明书 1份保存方式保存 缓冲液（reagent e）、 底物液（reagent f）、 终止液（reagent g）、 酶解液（reagent h）和 标准液（reagent j）在20冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4冰箱里； 底物液（reagent d）和 标准液（reagent j）避免光照，有效保证6月用户自备磷酸盐缓冲溶液（pbs）：用于清洗细胞样品15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器（微型）台式离心机：用于细胞预处理培养箱：用于反应物孵育酶标板或比色皿：用于反应和荧光分析的容器荧光酶标仪或荧光分光光度仪：用

6、于荧光分析 实验步骤 实验开始前，将20冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。一、样品准备1 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 x 107细胞）2 小心抽去培养液3 小心加入10毫升用户自备的磷酸盐缓冲溶液（pbs），覆盖生长表面4 小心抽去清理液5 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）6 加入xx毫升 裂解液（reagent a），混匀细胞7 移入到预冷的15毫升锥形离心管 8 强力涡旋震荡10秒9 置于冰槽里孵育15分钟10 加入xx毫升预冷的 分离液（reagent b），混匀11 放进4台式离心机离心10分钟，速度为1300

7、g 12 小心抽去上清液13 加入xx毫升预冷的 清理液（reagent c）14 放进4台式离心机离心10分钟，速度为1300g 15 小心抽去上清液16 小心加入xx微升预冷的 萃取液（reagent d），混匀17 转移到新的预冷的1.5毫升离心管18 超声处理30秒19 置于冰槽里孵育30分钟20 放进4微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000rpm，例如eppendorf 5415）21 小心移取上清液到新的预冷的1.5毫升离心管22 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 bradford蛋白质浓度定量试剂盒 hl30030.1）23 即刻放进70保存或置

8、于冰槽里继续后续操作二、 测定准备1 准备好待测样品（例如核蛋白或纯化酶样品等），置于冰槽里2 设定好荧光酶标仪或荧光分光光度仪（温度为30）：激发波长350-360nm；散发波长450-465nm 3 缓冲液（reagent e）置于室温下均衡温度4 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管5 分别加入xx微升 缓冲液（reagent e）到1至5号管6 移取xx微升 标准液（reagent j）到1号管，混匀7 小心移取xx微升1号管稀释的 标准液（reagent j）到2号管，混匀8 小心移取xx微升2号管稀释的 标准液（reagent j）到3号管，混匀9 小心移取xx微升3号管稀

9、释的 标准液（reagent j）到4号管，混匀10 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表管号 缓冲液（reagent e） 标准液（reagent j）标准氨甲基香豆素浓度1xx微升xx微升xx微摩尔/升2xx微升xx微升1号管xx微摩尔/升3xx微升xx微升2号管xx微摩尔/升4xx微升xx微升3号管xx微摩尔/升5xx微升00三、活性测定1 在96孔酶标板上做好相应标记：标准样品1至5管2 分别移取xx微升 缓冲液（reagent e）到相应孔中3 分别加入xx微升上述配制的 标准液（reagent j） 4 轻轻摇动96孔酶标板30秒5 即刻放进荧光酶标仪或转移到10

10、0微升比色皿，在荧光分光光度仪里检测：获得相对荧光单位（relative fluorescence unit；rfu）读数6 构建标准曲线：纵座标（y轴）为相对荧光单位（rfu）；横座标（x轴）为标准氨甲基香豆素浓度（微摩尔/升）四、活性测定1 在96孔酶标板上做好相应标记：背景空对照和待测样品2 分别移取xx微升 缓冲液（reagent e）到相应孔中3 分别加入xx微升 底物液（reagent f）4 分别加入xx微升 补充液（reagent i）或待测样品（50微克核蛋白或200微克细胞裂解萃取液总蛋白）（注意：样品须清澈）5 轻轻摇动96孔酶标板30秒6 放进30培养箱里，孵育60分钟

11、，避免光照7 分别加入xx微升 终止液（reagent g）8 分别加入xx微升 酶解液（reagent h）9 轻轻摇动96孔酶标板30秒10 在30培养箱里，孵育30分钟11 即刻放进荧光酶标仪或转移到100微升比色皿，在荧光分光光度仪里检测：获得相对荧光单位（relative fluorescence unit；rfu）读数12 根据标准曲线获得样品对应氨甲基香豆素浓度（微摩尔/升）四、 计算样品活性 方法一：rfu直接法方法二：标准氨甲基香豆素浓度测算法 注意事项1 本产品为20次操作2 操作时，须戴手套3 系统操作过程中，标准测定只需1次4 样品须澄清，至关重要 5 样品处理时，避免使用蛋白酶抑制剂、pmsf、烷基胺（alkyl amine）等6 孵育反应完成后即刻进行荧光测定7 测定值由低到高变化；测定持续60分钟8 测定值荧光读数越高，表明酶活性越高9 荧光测定后，比色皿须清洗彻底10 待测样本为核蛋白样品，其蛋白浓度为50微克/20微升；待测样本为细胞裂解悬液，其蛋白浓度为200微克/20微升（本公司提供 bradford蛋白质浓度定量试剂盒 hl30030.1）