《DNA测序原理》

1、第六章 DNA序列分析,人类基因组计划(human genome project, HGP),人类基因组计划(human genome project, HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。总体计划在15年内投入至少30亿美元进行人类全基因组的分析。,美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与。,我国承担其中1%的任务，即人类3号染色体短臂上约30亿个碱基的测序任务。,人类基因组,线粒体基因组,核基因组(约30亿个碱基),基因外序列,基因和基因有关序列,约10%,约90%,专一或中等重复序列,Non-coding DNA,假基因,内含子

2、,基因片段,10%,90%,专一的或低 拷贝数序列,中度至高度重复序列,2030%,7080%,分散重复序列,串联重复序列/ 成簇重复序列,约60%,约40%,蛋白编码 基因,rRNA 基因,tRNA 基因,Coding DNA,序列测定的技术,杂交测序法 质谱法 单分子测序法 原子探针显微镜测序法 DNA 芯片法,经典方法: Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977) Maxam-Gilbert DNA化学降解法(Maxam &Gilbert,1977),新技术方法:,与 PCR反应类似。 反应体系中包含：模板 DNA, Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测序引物； 反应过程

3、： 变性复性延伸终止,Sanger双脱氧终止法,Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸）,ddNTPs 是反应终止剂 可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。 反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般34 ：1)。,*,少一个OH,脱氧核甘酸 与 双脱氧核甘酸 结构比较,H,Sanger第一步：加入复制终止剂,荧光检测探头,电泳，看谁跑得快,ddNTPs参与下的DNA复制,Sanger法测序产物的平均链长取决于ddNTP与dNTP的比例，比例高时，得到较短的产物；,Gel Electrophoresis DNA Fragment Size Det

4、ermination,DNA 带负电 DNA在电泳胶中的迁移率与其片段大小有关,Sanger第二步：荧光检测,除核苷酸序列文本文件外，全自动测序仪还提供曲线图。,Maxam-Gilbert化学裂解法,一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。,碱基特异性化学切割反

5、应： 硫酸二甲酯（DMS ）：使DNA分子中鸟嘌呤（G）上的N7原子甲基化。 肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应。 哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。 在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。,G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。 G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。 T+C反应：肼（低盐） C反应：肼（高盐） 测定DNA长度250bp。,化学裂解法测定DNA的核苷酸序列,DNA片断序列测定的策略,测定未知序列的DNA片断 一

6、次测序结果有长度限制（1000bp) 通用引物指导未知序列的测定 引物步移 随机克隆测序 缺失克隆测序,通用引物指导未知序列的测定,根据载体序列设计通用引物测定待测DNA片断,引物步移策略 将待测DNA片断克隆在质粒载体上，利用引物步移延伸，从DNA片断的一端开始逐步进行序列测定，直至另一端为止。 克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备步骤，也减轻了数据分析工作量。 但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的碱基顺序，才能合成适当的引物进行测序。 定向缺失克隆策略、染色体步查法等。,鸟枪测序法(shotgun sequencing)：随机克隆测序 将待测的DNA片段随机打断并构建随机重叠克隆文

7、库，然后通过通用引物测定每个克隆中的待测DNA序列。当这些已测序列的数量达到一定程度后，相当于待测DNA片断的每一部位的序列也就被测定出来了，通过这些所测序列之间的重叠部分，最终可将整个DNA片断的序列拼接出来，这样的测序策略称为随机克隆测序。,将DNA大片段切割成小片段的三种方法： 限制性内切酶酶切 超声波处理 DNA酶I降解(加Mn2+),鸟枪法测序的缺点,随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加，造成重复测定，也易丢失某些序列，且数据处理分析工作量大。 高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致判断失误。,完整基因组的测序过程一般包括三个步骤： （1）建立克隆的物理图谱：如

8、酵母人工染色体YAC（Yeast Artificial Chromosome）克隆、细菌人工染色体BAC（Bacterial Artificial Chromosome）克隆等； （2）利用鸟枪法（Shotgun Strategy）测定每个克隆的序列； （3）序列拼装和注释：当得到一段DNA序列之后，可以利用序列分析工具，进行序列的拼接；继而通过与数据库序列的比较，得到与该序列相关的信息，如基因、调控元件、重复区域等，进而对序列的生物学特性进行注释。,基因组测序,DNA全序列,切成小段,小段和载体结合,结合后进行测序,Map fragments,Sequence overlappingfrag

9、ments,Assembledsequence,基因组DNA序列测定示意图 通过随机剪切得到的大分子DNA片段克隆到载体上。绘制出这些重叠片段的图谱，并对重叠片段进行测序，通过“拼装”得到基因组序列。另一种方法不是根据片段的染色体位置，而是根据其重叠部分进行“拼装”。,Sequence all fragments and assemble,实验一目的基因、载体的制备,（一）mRNA的提取，电泳检测、反转录 （二）PCR扩增目的基因 预习报告，实验报告当天做完实验后根据书上的相关部分内容及笔记书写。,实验二重组子构建,（一）载体酶切 （二）PCR产物酶切 （三）酶切产物的回收 （四）目的基因与载体的连接,实验三重组子转化,（一）感受态细胞的制备 （二）重组子的转化 （三）转化子的菌落PCR鉴定,第四章作业： Souther