第四章工业发酵灭ppt课件

1、第四章 工业发酵灭菌,第一节 灭菌的方法 第二节 培养基和发酵设备的灭菌 第三节 空气除菌,概念:灭菌、消毒、除菌、防腐,灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命物质的过程。 消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。 除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。 防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖 。,在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的不良后果：,1. 使生物反应的基质或产物，因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降。 2. 杂菌也会产

2、生代谢产物，这就使产物的提取更加困难，造成得率降低，产品质量下降。 3. 有些杂菌会分解产物，使生产失败。 4. 杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pH值，使反应异常。 5. 如果发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，使生产失败。,工业上具体措施包括：,1）使用的培养基和设备须经灭菌； 2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理； 3）设备应严密，发酵罐维持正压环境； 4）培养过程中加入的物料应经过灭菌； 5）使用无污染的纯粹种子。,第一节 灭菌方法,一、热灭菌法 火焰灭菌法 干热灭菌法 湿热灭菌法 二、辐射灭菌法 射线灭菌法 三、化学药剂灭菌法 四、臭氧灭菌 五、过滤除菌法,第二节 培养基和发酵设备的湿

3、热灭菌,一、概述 1、培养基灭菌的定义 是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。,2、培养基灭菌的目的 杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。,3、培养基灭菌的要求,达到要求的无菌程度（10-3）。 尽量减少营养成分的破坏。在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解,4、湿热灭菌中的相关定义,杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致

4、死时间愈短。 微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。,各种微生物对湿热的相对热阻,1. 微生物热死定律：对数残留定律 2. 灭菌温度和时间的选择 3. 影响培养基灭菌的其它因素,二、培养基灭菌条件的选择,1. 微生物热死定律对数残留定律,实验证明，在一定温度下，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定律。,式中， N：任一时刻的活细菌浓度（个/L）; t

5、：时间（min）; K：比热死速率常数（min-1）.,若开始灭菌（t = 0）时，培养基中活的微生物数为N0,t = 2.303 logN0/N /,- dN/dt = N,lnN/N0 = - t,积分,2.303logN0/N = t,or,可见灭菌时间取决于污染程度(N0)、灭菌程度（残留菌数N）和值,当Nt=0时， t=， 既无意义，也不可能。 一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。,例： 有一发酵罐内装40m3培养基，在121温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每ml有2105个耐热细菌芽孢， 121时灭菌速度常数为1.8min1。求灭菌失败几率为0.001时所需的

6、灭菌时间。,实验还证明，细菌孢子的热杀灭动力学与营养细胞的有所不同。它表现为非对数的死亡动力学。这可能与孢子壁的化学成分及结构有关。但当温度超过120C时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡动力学即符合一级反应规律。,大肠杆菌在不同温度下 的残留曲线,嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线,实验表明，当 T 变化时，k有很大变化，其变化遵从阿累尼乌斯定律 k=Aexp(- E/RT) （4） 式中，A：频率因子（min-1） E：活化能（J/mol） R：通用气体常数J/（mol.k） k与微生物活化能及T有关 ，其它条件相同时， E越高，K越低，热死灭速率越慢。,

7、对（4）两边取对数，得（5）： lnk = E/RT + lnA （5） K是E和T的函数，K的对T的变化率与E有关，对（5）两边对T的导数，得（6）,由（6）得：反应的E越高，lnK对T的变化率越大，即T的变化对K的影响越大。,2. 灭菌温度和时间的选择,培养物质受热破坏也可看作一级反应： 式中C：对热不稳定物质的浓度；k：分解速度常数； k的变化也遵循阿累尼乌斯方程：,都与相应的活化能及T有关,当T1 T2 (k2/k1)/(k2/k1)=E/E1 (EE) 随着T上升，菌死亡速率增加倍数大于培养基成分分解速率增加倍数，故一般选择高温快速灭菌 。,2. 灭菌温度和时间的选择,嗜热脂肪芽孢杆

8、菌孢子的EBS =67000 4.184（J/mol） 维生素B1的EVB=22000 4.184 （J/mol） 将灭菌温度从105C提高到127C KVB从0.02（min-1）提高到0.06（min-1） KBS从0.12（min-1）提高到40.0（min-1）,嗜热脂肪芽孢杆菌孢子和维生素B1的lnK-1/T图,嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为N/N0=10-16时，灭菌温度对维生素B1破坏的影响。,3. 影响培养基灭菌的其它因素,培养基成分 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的耐热性 低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随着浓度增加，保护作用减弱，当浓

9、度达8%-10%以上，则减弱微生物的耐热性。,pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热；pH6.0，H+易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促使其死亡。培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。,3. 影响培养基灭菌的其它因素,温度 孢子数 灭菌时间 (min) () (个/ml) pH=6.1 5.3 5.0 4.7 4.5 120 10000 8 7 5 3 3 115 10000 25 25 16 13 13 110 10000 70 65 35 30 24 100 10000 740 720 180 150 150,pH对灭菌时间的影响,培养基的物理状态颗粒大小。 泡沫：泡沫中的空气形成隔热层

10、，对灭菌极为不利，可加入少量消泡剂 。 培养基中的微生物数量：浓度越高，所需灭菌时间越长。,3. 影响培养基灭菌的其它因素,例如： 如肉毒梭状芽孢杆菌，在105湿热灭菌时间 芽孢杆菌数/ml 时间 (min) 9108 48 9106 36 9104 20 9102 14 9 2,二、培养基灭菌的方法,（一）分批灭菌 （二）连续灭菌,分空气过滤器灭菌 并用空气吹干,（一）分批灭菌（实罐灭菌） 1.灭菌工艺过程,升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单地利用式 (N/N0) =-kt 来粗略估算灭菌所需时间。,2. 灭菌时间的估算,2. 灭菌时间的估算

11、,例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在1210C温度下实罐灭菌，原污染程度为每1ml有2105个耐热细菌芽孢，已知121时灭菌速度常数k=1.8min-1，求灭菌失败机率为0.001时所需时间。 解：N0=401062105=81012(个) Nt=0.001(个) k=1.8(min-1) (Nt/N0)=-kt t=2.303/klg(N0/Nt)=2.303/1.8lg(81015) =20.34(min) 由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培 养基加热至1000C以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。,3、保证间歇灭菌成功的要素 （1）内部结构合理(主要是无死

12、角)，焊缝及轴封装置可靠，蛇管无穿孔现象 （2）压力稳定的蒸汽 （3）合理的操作方法。,（三）连续灭菌（连消）,工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程 灭菌时间的计算 (Ct/C0)=kt t=2.303/klg(C0/Ct) 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。,例2某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有2105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间。,连续灭菌时间的估算,解：C0=2105(个/ml) Ct=0.001/(40106)=2.51

13、0-11(个/ml) t=2.303/klg(C0/Ct)=2.303/15lg(2105)/(2.510-11) =2.37 min,分批灭菌与连续灭菌的比较,连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。,缺点： 对小型罐无优势，不方便，对设备要求高； 蒸汽波动时灭菌不彻底； 当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。,分批灭菌与连续灭菌的比较,

14、三、发酵罐的灭菌,培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法。则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。 通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或设管并从空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从排气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持1公斤，20分钟。在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压，防止形成真空而吸入带菌的空气。,第三节 空气除菌,空气除菌的必要性 以一个50m3的发酵罐为例，若装料系数为0.7，要求每立方米发酵液每分钟通气0.8m3，培养周期170h，那么每个周期需通气量2.86105 m3(500.7 0.8 170 60)，而每立方米大气中约有103-104个微生物。,无菌空气的概念

15、,发酵工业应用的“无菌空气”是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。,一、空气中的微生物分布,一般寒冷的北方比暖和、潮湿的南方含菌量少； 离地面越高，含菌量越少，高度增加10m，微生物数量减少一个数量级； 工业城市比农村含菌量高。,各地空气中所悬浮的微生物种类及比例各不相同，数量也随条件的变化而异，一般设计时以含量为103104个m3进行计算。,二、空气除菌的方法,辐射杀菌：超声波、高能阴极射线，x射线、射线、射线、紫外线(2265 3287 ) 加热杀菌：加热方法可用蒸汽、电和空气压缩机产生的热量 静电除菌 ：常用于洁净工

16、作台、洁净工作室所需无菌无尘空气的第一次除尘，配合高效过滤器使用。 过滤除菌：采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气所含的微生物而取得无菌空气。常用的过滤介质有棉花、活性炭、玻璃纤维、有机合成纤维、有机和无机烧结材料等等。,三、介质过滤除菌,绝对过滤：过滤介质的滤孔小于细胞和孢子。 如聚乙烯醇缩甲醛树脂（PVF）制成的0.3 m的微孔滤膜。 深层介质过滤：介质的孔隙一般大于微生物细胞。 如用棉花、玻璃纤维和颗粒活性炭填充的过滤器。,深层过滤器除菌机理,1惯性冲击滞留作用机理,当气流前进时遇到前面的阻碍物而突然改变方向，但颗粒由于惯性力的作用仍然沿直线运动与纤维碰撞而附着在纤维表面，此颗粒就被捕集了

17、。,2 拦截滞留作用机理 当气速降至以下时，惯性冲击作用已不存在，然而存在着另一种作用，即拦截作用来捕集微粒。这是因为颗粒紧紧地随着气流流动，气流改变流向时颗粒也跟着改变方向，当颗粒与纤维表面接触时就捕集了。,3 布朗扩散滞留作用机理 有些直径微小的微粒在很慢的气速下作不规则的直线运动，这就是布朗扩散。小颗粒呈布朗运动而发生位移，当它与纤维接触就附着于纤维表面而被捕集了。前提是 。,4、重力沉降作用 5、静电吸附作用,当气流速度较高时，以惯性冲击为主，而当气流速度低于一定限度时，以阻拦和扩散为主，并可认为惯性冲击不起作用。此时的气流速度称为临界速度 。,(三) 介质除菌效率,介质除菌效率（）又

18、称介质捕集效率，是指被介质捕集的尘埃颗粒数与空气中原有颗粒数之比。,N2Nl：过滤前后空气中的微粒含量比值，即穿透滤层的微粒数与原有微粒数的比值，称为穿透率。,（四）空气过滤介质,棉花 玻璃纤维 活性炭 超细玻璃纤维纸 石棉滤板 烧结材料过滤介质 新型过滤介质,1. 棉花：品种不同，要求新鲜，纤维长而疏松， 贮存时间长的话，纤维易断，易堵塞。 2玻璃纤维：直径小，不易折断，过滤效果好。阻力损失小 3活性炭：强度高，表面积大，空隙大， 阻力小，只有棉花阻力的1/12。 缺点：体积大，装填费时费力，松紧度不易掌握，空气压降大。,4超细玻璃纤维纸： 超细玻璃纤维纸是上好的无碱玻璃，喷吹成丝状纤维，再

19、以造纸法做成。该过滤为高气速过滤，气流速度越高，效率越高。但超细玻璃纤维纸强度小，易断，多用于分过滤器。为了增加强度，可添加： 木浆纤维。但效率较低； 环氧树脂； 多层复合使用。可增加强度，厚度0.25mm。, 5.石棉滤板：20石棉，80其它纤维， 厚度35mm，纤维短，df粗， 效率高。特点：不怕水， 受潮不易穿孔和折断。,四、空气过滤除菌的工艺流程,1、空气除菌流程的要求 空气应具有一定的压力，过滤器要高效，设备尽量采用新技术，流程尽可能简化，降低动力消耗，工人操作简便，运转费用低。设备中要用无油润滑，否则有油雾，影响过滤效率。,发酵生产中制备无菌空气的大致过程,空气的预处理 目的: 提

20、高压缩前空气的洁净度; 去除压缩后空气中的油和水。,1. 提高压缩前空气的洁净度 （1）提高空气吸气口的位置 （2）在空气入口处设置粗过滤器 捕集较大的灰尘颗粒，并保护空压机。,高空取气管,为远离地面几十米的管子。 每升高10米，空气中杂菌降低一个数量级。因此从高空取气要比从低空取气有利得多。,2.空气压缩和压缩空气的冷却 （1）空气压缩：克服输送过程中过滤介质的阻力并维持一定的气流速度。 （2）压缩后空气温度显著上升，需冷却，因为,压缩后的高温空气能引起过滤介质的炭化或燃烧 增大发酵罐的降温负荷 增加培养液水分的蒸发 一般用列管式冷却器进行冷却。,空气贮罐 消除压缩机排出空气量的脉冲，维持稳

21、定的空气压力。 利用重力沉降作用除去部分油雾。 紧接空压机安装。 有些装有冷却管。,3. 压缩空气的除油除水 冷却降温后的空气湿度增大，会使过滤介质受潮失效。,两类设备 旋风分离器利用离心力进行沉降，对于10m以上的微粒分离效率较高。 丝网分离器利用惯性进行拦截，分离效率较高，能除去25m的细小颗粒。,旋风分离器,采用惯性拦截等机理，有效去除空气中的水、油雾、尘埃，不锈钢丝网可清洗，使用寿命长。,4.空气的加热 将除油水的空气加热（温差在1015C 左右），降低相对湿度（达50%60%）后，输入过滤器。 用列管换热器。,空气过滤除菌设备流程,空压机,储罐,二级冷却,加热器,空气过滤,粗过滤,空

22、气过滤器 过滤除菌的关键设备,几种典型的设备流程,两级冷却、加热除菌流程 冷热空气直接混合式空气除菌流程 高效前置过滤空气除菌流程 将空气冷却至露点以上的流程 利用热空气加热冷空气流程 一次冷却和析水的空气过滤流程,两级冷却、加热除菌流程图 1-粗过滤器；2-空压机；3-贮罐；4，6-冷却器；5-旋风分离器；7-丝网分离器； 8-加热器；9-过滤器,冷热空气直接混合式空气除菌流程图 1-粗过滤器；2-压缩机；3-贮罐；4-冷却器；5-丝网分离器；6-过滤器,利用热空气加热冷空气的流程示意图 1-高空采风；2-粗过滤器；3-压缩机；4-热交换器；5-冷却器；6，7-析水器；8-空气总过滤器；9-

23、空气分过滤器,将空气冷却至露点以上的流程 1高空采风；2粗过滤器；3压缩机；4冷却器；5冷却器；6空气总过滤器；7空气分过滤器,高效前置过滤空气除菌流程图 1高效前置过滤器；2压缩机；3贮罐；4冷却器；5丝网分离器；6加热器；7过滤器,一次冷却和析水的空气过滤流程示意图 1高空采风；2粗过滤器；3压缩机；4冷却器；5，6析水器；7贮罐；8加热器；9空气总过滤器；10空气分过滤器,180M3发酵罐车间,大型空气压缩机,发酵车间的空气过滤器,提高过滤除菌效率的措施,减少进口空气的含菌数量，主要方法：正确选择进风口；提高进口空气的采气位置；采用粗过滤预处理。 设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率

24、高的过滤介质。 针对不同地区，设计合理的空气预处理工艺流程，以达到除油、水和杂质的目的 。,降低进入空气过滤器的空气相对湿度，保证过滤介质能在干燥状态下工作，主要方法：使用无油润滑的空气压缩机；加强空气冷却和去除油、水；提高进入过滤器的空气温度。 稳定压缩空气的压力，采用合适容量的贮气罐。,提高过滤除菌效率的措施,化学药剂灭菌,某些化学药剂能与微生物细胞物质发生反应而具有杀菌作用。如甲醛、氯（或次氯酸钠）、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐（如新洁尔灭）等。,射线灭菌,紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的高能粒子能起到灭菌的作用。波长为2.53710-7的紫外线有灭菌效果。,干热灭菌,160保温1 h。 主要针对必须保持干燥的实验器具或材料（培养皿、接种针、固定化细胞用的载