蛋白质样品的初级分离

1、2 蛋白质样品的初级分离,混合物分离,破 碎,选 材,离 心 沉 淀 萃 取 吸 附 膜分离,初 级 分 离,（pretreatment）,第一节 蛋白质样品的选材与破碎,1 制备蛋白质的原材料的选择和处理,微生物：注意生长期 分泌到培养基中代谢产物、胞外酶 菌体含有的生化物质如胞内酶、核酸 植物： 去壳、脱脂、品种、季节、生长发育 动物： 含量丰富的脏器组织为原材料,1.1 天然蛋白质的制备材料,对于处理的材料，若不立即进行试验，应冷冻保存。 对易分解的蛋白质应选用新鲜材料制备。,1.2 重组蛋白质的制备材料,重组蛋白可在e.coli、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等体系中得到高效表达，其表达形式

2、一般可分为： （1）细胞外的分泌表达； （2）细胞内可溶性表达； （3）细胞内不溶性表达（包涵体）,1.3 制备蛋白质的原材料的预处理,为了纯化蛋白质，采用有效的方法进行组织细胞或培养细胞的破碎是提取胞内蛋白质的关键步骤。,1.3.1 细胞的破碎方法,1.3.1.1机械破碎法,1.3.1.1机械破碎法,1高速搅拌珠磨法（fine grinding）：是将细胞悬浮液与研磨剂（如：玻璃小珠、石英砂或氧化铝等）一起快速搅拌或研磨，利用玻璃珠间以及玻璃珠与细胞间的互相剪切、碰撞促进细胞壁破裂而释放出细胞内含物。,影响珠磨破碎的因素：转盘外缘速率：在一定范围内细胞破碎的比速率与转盘外缘速率成正比；细胞浓

3、度：该影响目前还没有定论；磨珠大小及用量：一定范围内，细胞破碎速率与磨珠大小成反比，与磨珠用量成正比。温度：540内对破碎物影响较小，但对于热不稳定性产物，应采用冷却装置控温。流量：提高流量，则降低细胞的破碎程度和释放蛋白的产量。,珠磨法优点：可实现连续操作；缺点：破碎中产生大量的热量会使样品迅速升温，需采取冷却装置。适用于真菌和藻类细胞。,1.3.1.1机械破碎法,2高压匀浆法（homogenization）：是利用高压迫使细胞悬浮液通过针型阀后，因高速撞击和突然减压而使细胞破碎的方法。,操作方式: 可采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难

4、破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。,影响因素： 循环次数(n)： rm / ( rm-r) =np 温度：破碎率随温度升高而增加 操作压力：细胞破碎速率与操作压力大小成正比 针型阀与阀座的形状及二者的距离,优点：可多次循环，操作方便、成本较低。因此，该法已大规模应用于多种微生物细胞，尤其是酵母和细菌。,1.3.1.1机械破碎法,3超声波破碎法（ultrasonication）：是利用超声波振荡器发射的1525 khz的超声波探头来处理细胞悬浮液而使细胞破碎的方法。,破碎原理：在超声波作用下，液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破

5、碎。,影响参数：振幅：振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的比速率（正相关）；细胞悬浮液的黏度：黏度影响能耗并会抑制空穴现象；珠粒的大小：细小珠粒利于空穴的形成，并产生辅助“研磨”效应，从而提高破碎速率。其它：如：探头的形状和材料，细胞悬浮液的流速、体积等。,1.3.1.1机械破碎法,4振荡珠击破碎法 (skaking bead)：将等体积的小量组织样品与高密度的zircobeads放入可密封的2ml螺旋盖微量管中,再加入缓冲液与稳定成份到1.5ml的体积, 用6500rpm振荡机高速上下振动8秒,休息8秒,再振动8秒即可.,机械法破碎细胞的缺陷,需要高能量，并且产生高温和高剪切力，因此易使不稳

6、定产品变性失活； 破碎目标不具专一性（被破碎的有机体或释放产物是非专一的）、易形成碎片颗粒，这为后续分离纯化工作带来难度。,1.3.2.2非机械破碎法,1.3.1.2非机械破碎法,1）化学破碎法：采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。这种用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞内某些组分的方法就称为化学破碎法 。,作用机理：表面活性剂、变性剂等化学试剂可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内含物有选择地渗透出来。,常用化学试剂：酸、碱、表面活性剂、变性剂、金属螯合剂、和某些有机溶剂（如苯、甲苯）等。,常用化学破碎法：渗透压冲击法、增溶法和脂溶法等。,化学破碎法的特点,存在的问题：时间长，效率低；化学试

7、剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。,优点：多用于破碎细菌，且作用比较温和；提取核酸时，常用此法破碎细胞。,1.3.2.2非机械破碎法,2）生物破碎法（酶溶法）：是利用生物酶消化溶解细胞壁和膜，从而导致细胞壁膨胀、破裂，释放出内含物的方法。,常用的溶酶：溶菌酶、-1,3-葡聚糖酶、-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等。,自溶：将新鲜的生物材料存放于一定的ph 和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来，此法称为

8、自溶法。自溶是一种特殊的酶溶方式。,例如：酵母在4550下保温20h左右，即可发生自溶。但该法使用时要特别小心操作，因为水解酶不仅可以使细胞壁和膜破坏，同时也有可能会把某些要提取的有效成分分解。另外，自溶的时间较长，不易控制，故在制备生物活性时很少用之。,1.3.1.2非机械破碎法,3）物理法：主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法。,常用的物理法：反复冻融法、急热骤冷法和干燥法等。,小结,众多细胞破碎方法中，高压均浆和珠磨两种机械破碎方法，处理量大，速度非常快，目前在工业生长上应用最广泛。但在机械法破碎过程中，容易产生大量的热量，使料液温度升高，而易造成生化物质的破坏，特别是在超声波处理时

9、。因此，超声波振荡法主要适用于实验室或小规模的细胞破碎。 非机械法一般仅适用于小规模应用。渗透压冲击和冻结融解法都属于较温和的方法，但破碎作用较弱，它们常与酶解法结合起来使用，提高破碎效果。干燥法属于较激烈的一种破碎方法，容易引起蛋白质或其它组分变性。,各种组织适用的细胞破碎方法,细胞对破碎方法的敏感性,细胞 声波 机械 渗透压 冻融 动植物 + + + + 革兰氏阴性菌 + + + + 革兰氏阳性芽孢菌 + + + + 酵母 + + + + 革兰氏阳性球菌 + - + + 菌丝 - + - + 孢子 - - - -,1.3.1.3选择破碎方法的依据,细胞的处理量 细胞的密度和细胞壁的强度 目

10、标产物对破碎条件的敏感性以及产物在细胞中的位置 破碎程度 产物的稳定性 提取分离的难易,1.直接测定破碎前后的细胞数： 破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数； 破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。 2.测定导电率： 利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。 3.测定释放的蛋白质量或酶活力： 测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。,1.3.1.4 细胞破碎确认,细胞破碎率的评价,破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即： y(%)=(n0-n) / n0100 。注： n0 原始细胞数量；n经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量。,细胞破碎率的计算方法,n0和

11、n主要通过直接计数法和间接计数法两种方法获得。,第二节 目标蛋白质的离心分离,离心分离技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的技术。,2.1 离心技术的原理,将处于悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等称为“颗粒”。每个颗粒都有一定大小、形状、密度和质量。当离心机转子高速旋转时这些颗粒在介质中发生沉降或漂浮，它的沉降速度与作用在颗粒上的力的大小和力的方向有关。,离心力： fc = m ac m r 2 m r （2 n/60）2 n为离心机每分钟转数 （r/min ）； fc通常以相对离心力rcf（relative cent

12、rifugal force）表示，即离心力f的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少倍。一般用g（或数字g）表示。,2.1.1 相对离心力,rcf = m r （2 n/60）2 /mg= 1.12 10-5 n2 r 此公式描述了相对离心力与转速之间的关系 旋转半径用r平均代替 r平均=1/2（r大+r小）cm,通 常： 低速离心以每分钟的转数表示，如：4000r/min。 高速离心（超速），常以相对离心力（rcf）表 示，如：65000g。 两者可换算或查测算图。,计算近似rcf的列线图,2.1.2 沉降系数:（sedimentation constant） 指单位离心力下颗粒的沉降速度（

13、sedimentation velocity）,用s表示。 由于许多生物大分子的s值很小，所以定义10 13 s 为一个沉降单位，1s = 11013 s。 常用s表示某些生物大分子、亚细胞及亚细胞器的大小，如16srna，蛋白质的沉降系数一般在1 200之间。,2.1.3 离心条件的确定,离心力 离心时间（与颗粒的沉降时间有关） 温度和ph值（防止欲分离物质的凝集、变性和失活）,n：转子每分钟转数，r/min,2.2 离心机的种类 按离心机转速的不同，分为： 常速（低速） 高速 超速,离心机的种类,实验室离心机,温度类型：常温及冷冻 超速离心机均为冷冻型。 使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心

14、头。 使用超速离心机时先抽真空。,离心的形式,角式及外摆式：外摆式一般为低速， 角式由低速到超速均有。,角式离心机和离心头（转子）,角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。,离心机的大小：落地式及台式,小台式离心机,离心管,材质：玻璃，塑料 强度：和离心速度相配 大小：和转子配套 高速超速管要加盖,离心机操作,平衡、定温、定速、定时。,2.3 离心分离技术的种类,差速离心法是指通过不断增加相对离心力，使沉降速度不同的颗粒，在不同离心速度及不同离心时间下分批离心方法。差速离心法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。主要用于分离细胞器和病毒。,差速离心法(differential c

15、entrifugation),密度梯度离心法,亦称平衡密度梯度离心法。密度梯度离心法包括速度区带和等密度离心二种方法。后者又可分为预制梯度等密度及自形成梯度等密度两种方法。,速度区带离心法,在离心前离心管内预先装入密度梯度介质(如蔗糖、甘油、kbr、cscl等)，待分离的样品铺在梯度液的顶部或梯度层中间，同梯度液一起离心。由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带。沉降系数越大，往下沉降越快，所呈的区带也越低。沉降系数较小的颗粒，则在较上部分依次出现。,蔗糖密度梯度离心,等密度离心法,某些密度梯度介质经过

16、离心后会自身形成梯度，如细胞分离液percoll。待分离样品可和梯度介质先均匀混合，梯度介质由于离心力的作用逐渐形成管底部浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的颗粒也发生重新分布。当管底介质的密度大于颗粒的密度时，颗粒上浮；当管顶介质的密度小于颗粒的密度时，则颗粒沉降；最后颗粒进入到一个它本身的密度位置，颗粒不再移动，形成稳定的区带。,2.4 超速离心,超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质，也可以用作测定蛋白质的分子量。 超速：50000-120000rpm,大容量冷冻离心机,2.5 应用 根据不同离心目的，分为 制备性离心： 分离纯化和制备 分析

17、性离心： 测分子量、沉降系数、密度、纯度,第三节 蛋白质的沉淀分级,概念 溶液中溶质由液相变成固相析出的过程。 本质 通过改变条件使胶粒发生聚结，降低其在 液相中的溶解度，增加了固相中的分配率。 作用 分离、澄清、浓缩、保存,3.1 沉淀技术,3.2 沉淀的分类,沉淀的分类,晶形沉淀,凝乳状沉淀,胶状沉淀,baso4 mgnh4po4,实例,颗粒半径,agcl,fe2o3.nh2o,al2o3.nh2o,0.1 1 m,0.02 m,主要成因,沉淀时的条件,沉淀自身性质,沉淀外观,crystalline precipitate,amorphous precipitate,不定型,g.g. ch

18、en et al. powder technology 139 (2004),180-185.,溶剂性质对沉淀的影响,baso4沉淀的tem(透射电子显微镜）成像,纯水中沉淀,20%乙醇中沉淀,超细硫酸钡(200nm)具有优良的光学性质、流体性质，在燃料、医药业广泛应用。,3.3 沉淀的形成过程,构晶离子,晶核,沉淀微粒,无定形,晶形,无定形沉淀过程示意,晶形沉淀过程示意,沉淀的形成是一个复杂的过程，由于纳米材料科学技术的发展，这一领域的研究很活跃。,文献选读,文献选读,无定形沉淀形成示意,晶形沉淀过程示意,成核作用,成核作用,均相成核,异相成核,均相成核是在过饱和状态时，构晶离子由于静电作用

19、缔合形成,异相成核是以固相微粒起着晶核的作用,相对的,绝对的,q 瞬时浓度,s 晶核的溶解度,异相成核,异相成核均相成核,临界点,临界点,baso4 1000,agcl 5.5,von weimarn 公式,3.4 沉淀微粒大小的影响因素,沉淀微粒大小,成核速度,晶核长大速度,晶核长大速度,成核速度,小的沉淀微粒,大的沉淀微粒,温度、搅拌等沉淀条件,浓度,3.5 沉淀的纯度,影响沉淀纯度的因素,共沉淀 coprecipitation,后沉淀 postprecipitation,吸附 adsorption,包藏 occlusion,混晶 mixed crystal,表面吸附,表面吸附作用力,静电

20、力,例,扩散层,吸附层：构晶离子,扩散层：抗衡离子,吸附原则,溶解度小,电价高,浓度大,溶解度(mol/l)：25c,表面吸附影响因素,沉淀表面积,温度,杂质浓度,例：以氨水沉淀fe(oh)3时，ca2+ 、mg2+ 、 zn2+ 、 ni2+ 4种杂质离子的吸附量的变化示意如图,作用力静电力，符合吸附规则,包藏 occlusion,硫酸钡的共沉淀（30c),化学平衡过程,混晶或固溶体,baso4-pbso4,同型混晶,半径相近，晶体结构相同,agcl-agbr,异型混晶,晶体结构不同,mnso45h2o-feso4 7h2o,后沉淀,后沉淀现象是指一种本来难以析出沉淀的物质，或是形成稳定的过

21、饱和溶液而不能单独沉淀的物质，在另一种组分沉淀之后被“诱导”而随后也沉淀下来的 现象，而且它们沉淀的量随放置的时间延长而加多。,例，在0.01 mol/l zn2+的0.15 mol/l hcl，通h2s, zns形成过饱和溶液，若加入cu2+,共沉淀与后沉淀对分析结果的影响的处理,表面吸附,包藏,混晶,后沉淀,洗涤，改善沉淀条件,重结晶,预先分离,立即过滤，不陈化,3.6 沉淀条件的选择,晶形沉淀,稀,热,慢,搅,陈,相对过饱和度小，减少均相成核；,减少杂质吸附量,增大溶解度，减少相对过饱和度，减少均相成核；,增大扩散速度，有利于沉淀长大；,减少吸附,减少均相成核；,有利于沉淀长大,减少包藏

22、；,晶形完整化,控制相对过饱和度小，沉淀陈化,无定形沉淀,减少水合，使其聚集紧密，便于过滤；减少杂质吸附,热,大量电解质,立即过滤,减少水合，减少吸附，防止胶溶,浓,减少水合。沉淀完后，稀释搅拌，减少杂质吸附,快，搅,减少水合,利于凝聚、沉降,3.7 沉淀方法分类,盐析 有机溶剂沉淀 等电点沉淀 非离子聚合物沉淀 其他沉淀技术,生成盐复合物 选择性变性 亲和沉淀,3.7.1 盐析,3.7.1.1 原理 “盐溶” 低浓度中性盐离子对蛋白质分子表面极性基团及水活度的影响，增加蛋白质与溶剂相互作用力，使其溶解度增大。 “盐析” 中性盐浓度增加至一定值时，水分子定向排列，活度大大减少，蛋白质表面电荷被

23、中和，水膜被破坏，从而聚集沉淀。,影响盐析的因素,盐离子种类和浓度 生物分子种类和浓度 ph值 温度,3.7.1.2 公式和讨论,纯蛋白质有盐析经验公式： log s = ksi s 蛋白质溶解度（g/l）； i=0时log s，它取决于盐和pr的性质，温度，ph； ks 盐析常数，决定于加入盐性质及pr性质； i 盐浓度（mol/l）,原始浓度p,p小，盐析所需i高；p大，盐析所需i低 对混合pr的盐析，p大，会发生严重共沉作用，一般控制浓度为2.53%。,混合pr的盐析,合适盐析范围的选择 不同pr盐析峰有重叠，须权衡纯度回收率。 改变原始浓度 一种蛋白质的不同浓度的沉淀曲线会变化 二次盐

24、析 在原盐浓度下二次盐析，可除去易溶杂质，但不能除去难溶杂质。,3.7.1.3 盐析操作要点,可使用的中性盐有：(nh4)2so4、na2so4、mgso4 nacl 、naac 、 na3po4 、柠檬酸钠等 以(nh4)2so4 、na2so4最广泛，前者最受欢迎,盐的种类及选择：,盐析范围的确定,可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得。（从回收率和纯度考虑）,确定盐析范围举例,取小样分段盐析，从回收率和纯度考虑来确定范围,盐的加入方式,固体 缓慢加，防泡沫，要平衡 液体（饱和盐溶液） 要求盐析范围小于50%饱和度 盐析反应完全需要一定时间，一般硫酸铵全部加完后，应放置30min以上才可

25、进行固-液分离。,透析盐析 将pr溶液盛于透析袋中，放入一定浓度的盐溶液中，由于渗透压的作用，袋中盐浓度连续性变化，使pr沉淀。 反抽提法（back-extraction） 将包括要分离的pr在内的多种pr一起沉淀出来，然后选择适当的递减浓度的硫酸铵来抽提沉淀物。,3.7.1.4 盐析操作的其他方法,3.7.1. 5 沉淀的再溶解,将沉淀溶于下一步所需的缓冲液（12倍）,3.7.1. 6 脱 盐,透析,超滤 根据所加操作压所用膜平均孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透。 凝胶过滤层析 此法脱盐时间短，效果好。,3.7.2 有机溶剂沉淀,3.7.2.1 基本原理 使溶液的介电常数大大降低，从

26、而增加带电粒子自身之间的作用力，易聚集沉淀；介电常数与静电引力的关系，可用库仑公式表示: 争夺酶、蛋白质等物质表面的水分子，破坏水化层，使分子易碰聚产生沉淀。,几种溶剂的介电常数,3.7.2.2 特 点,优点 分辨能力比盐析高,即一种生物分子或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉析；沉析不用脱盐，过滤比较容易。 缺点 是某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。,3.7.2.3 沉淀条件,温度 生物大分子在有机溶剂中对温度敏感，易变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应； 有机溶剂必须预先冷至较低温度，一般在0以下，操作时要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂必须缓慢，并不断

27、搅拌以免局部浓度过浓； 温度越低，得到的生物活性物质越多，而且可以减少有机溶剂的挥发； 温差分级沉淀；,ph 尽可能选择样品溶解度最低的ph，通常是选在等电点附近，以提高该沉析的分辨能力 要选择在样品稳定的ph范围内，少数生物分子在等电点附近不稳定，影响其活性 尽量避免目的物与杂质带相反电荷而加剧共沉现象的发生,样品浓度 样品浓度低时增加有机溶剂投入量和损耗，降低了溶质回收率，易产生稀释变性，但共沉的作用小，有利于提高分离效果 对于高浓度的生物样品，节省了有机溶剂，减少了变性的危险，但共沉作用大，分离效果下降 蛋白质0.53，黏多糖12,离子强度 在有机溶剂和水的混合液中，当离子强度很小，物质

28、不能沉析时，补加少量电解质即可解决 离子强度达一定程度时(0.10.2 mol/l以上) ，会增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解度，需大量的有机溶剂来沉析，并可能使部分盐在加入有机溶剂后析出 一般离子强度在0.05 mol/l或稍低为好，既能使沉析迅速形成，又能对蛋白质或酶起一定的保护作用，防止变性,多价阳离子的影响 某些金属离子具有助沉作用，蛋白质与zn2+、ca2+等形成复合物，使蛋白质在水和有机溶液中的溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉析形成，并降低有机溶剂的耗量 0.0050.02 mol/l的zn2+可使有机溶剂用量减少l/3至1/2 使用时要避免会与这些金属离子形成难溶盐的阴离

29、子(如磷酸根)的存在。,3.7.2.4 沉淀条件,有机溶剂的选择 常用乙醇、丙酮、甲醇 溶剂用量 v= v0（s2s1）/（100s2） 分级沉淀,3.7.3 等电点沉淀,调节两性生化物质溶液的ph值，以达到某一生化物质的等电点，使其从溶液中沉淀析出而实现分离的技术称为等电点沉析技术。,等电点(pi)是两性物质在其质点的净电荷为零时介质的ph值，溶质净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，沉淀析出，此时溶质的溶解度最低。,原 理,应 用,在生化产品的分离纯化过程中，常利用两性物质如氨基酸、蛋白质、多肽、酶、核酸等具有不同的等电点的特性来进行产品的分离纯化。 等电点沉淀只适用

30、于水化程度不大，在等电点时溶解度很低的物质，如四环素等在等电点(ph=5.4)附近，难溶于水，能产生沉析；疏水性较大的蛋白质（如酪蛋白） 可以与其他沉淀方法结合使用,3.7.4 其它沉淀技术,1 ）非离子多聚物沉淀法：peg和pvp 2 ）选择性变性沉淀：热变性沉淀、ph变性沉淀、有机溶剂变性沉淀 3 ）生成盐类复合物沉淀：金属复合盐法、有机酸复合盐法 4 ）亲和沉淀,3.7.5 应用实例,-等电点沉淀法分离牛乳中的酪蛋白,材料与试剂：鲜牛奶、醋酸钠、优级纯醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸馏水、0.2mol/l ph 4.7醋酸-醋酸钠缓冲液,将鲜牛奶30 ml及醋酸-醋酸钠缓冲液30ml分别水浴加

31、热40左右，并用8层纱布过滤牛奶 量取加热后的牛奶20ml，在搅拌下慢慢加入加热后的醋酸-醋酸钠缓冲液20ml，用酸度计调ph至4.7 将上述混合液冷至室温，离心（3500r/min）15min，弃去上清液，得酪蛋白粗制品,方法步骤：,用缓冲液洗沉淀3次，离心（3500r/min）10min，弃去上清液 在沉淀中加入20ml乙醇，搅拌片刻，将全部的悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤，用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次，最后用乙醚洗沉淀2次，抽干 将沉淀摊开在表面皿上，风干得酪蛋白纯品 准确称量，计算含量和收率,第四节 萃取技术,天然产物分离与纯化,（1）概述 （2）液液萃取技术 （3）超临界流体萃取 （4）

32、双水相萃取 （5）其它萃取技术 基本要求 掌握液液萃取技术的方法和基础原理，常用的浸提技术和新型的萃取技术，了解萃取技术在药物和食品生产的应用情况。,教学内容,1842年 ，e.-m.佩利若研究了用乙醚从硝酸溶液中萃取硝酸铀酰。 1903年，l.埃迪兰努用液态二氧化硫从煤油中萃取芳烃，这是萃取的第一次工业应用。 20世纪40年代后期，生产核燃料的需要促进了萃取的研究开发。 现今，萃取已应用于石油馏分的分离和精制，铀、钍、钚的提取和纯化，有色金属、稀有金属、贵重金属的提取和分离，抗菌素、有机酸、生物碱的提取，以及废水处理等。,沿 革,萃取 利用物质在互不相溶的两相之间溶解度的不同而使物质得到纯化

33、或浓缩的方法。 反萃取 调节水相条件，将目标产物从萃取相转入水相的萃取操作。 物理萃取 根据相似相溶的原理，溶质在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质之间不发生化学反应的萃取过程。 化学萃取 利用萃取剂与溶质之间的化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相的分配。,一、概述,萃取操作示意图,杂质,溶质,原溶剂,萃取剂,light phase,heavy phase,萃取、洗涤和反萃取操作过程示意图,分配系数,衡量萃取体系是否合理的重要参数： y-平衡时溶质在轻相中的浓度 x-平衡时溶质在重相中的浓度,分配定律的适用条件,稀溶液 溶质与溶剂之间的互溶度没有影响 分子类型相同，不发生缔合或解离,分类,

34、液-固萃取 液-液萃取 超临界萃取 双水相萃取 其他萃取技术,原理：属于用液体提取固体原料中有用成分 的扩散分离操作。 应用：多用于提取存在于胞内的有效成分。,一、液-固萃取,分子扩散：固体样品表面/溶剂接解处 影响因素：温度、分子大小和液体介质的黏度。 对流扩散：远离固体样品表面处的扩散 影响因素：流动液体的速度和状态，液体的黏度、样品表面的性质等。,固体萃取溶剂振荡（加热）离心/过滤分离欲萃取组分进入溶剂。,索氏萃取装置和k-d浓缩器,萃取装置,影响液-固萃取的因素,固体物料颗粒度 液-固萃取溶剂 浸取操作条件的影响,二、液-液萃取,原理： 利用溶质在两个互不混溶的液相（通常为水相和有机溶

35、剂相）中溶解度和分配性质上的差异进行的分离操作。,应用: 可用于有机酸、氨基酸、维生素等生物小分子的分离纯化。,两种不相溶 的液体,水溶剂：亲水化合物进入到水相中。,有机溶剂：疏水性化合物将进入有机相中的程度就越大。,液-液萃取步骤,溶剂体积为样品溶液的30-35。,振荡几次,打开活塞,gas,蒸气逸出（也叫放气）,絮状物 （乳化）,有机相,水相,水相和絮状物,静置分层,激烈振摇 1 - 2min,流程： 混合： 分离： 溶剂回收：,液-液萃取操作方式和流程,方式： 分批萃取连续萃取 单级和多级萃取 多级错流萃取和多级逆流萃取,单级萃取示意图,多级错流萃取示意图,多级逆流萃取示意图,影响溶剂萃

36、取的因素,萃取剂（有机溶剂） 水相物理条件 乳化现象,溶剂的选择原则,（1）对被分离物质溶解度大而对杂质溶解度小的溶剂（使 被分离物质从混合组分中有选择性地分离） （2）对被分离物质溶解度小而对杂质溶解度大的溶剂 （3）溶剂的选择原则：“相似相溶” 常见溶剂的极性大小顺序： 饱和烃类全氯代烃类不饱和烃类醚类未全氯代烃类酯类芳胺类酚类酮类醇类,产生乳化的原因,由于液-液萃取过程中剧烈振动，经常发生乳化现象，特别是那些含脂肪的样品。 原因：体系的性质、离子浓度、有机相粘度、萃取温度、ph等。 温度越低，有机相粘度越大 离子浓度越高越易产生乳化。,破乳的常用方法,1）加入表面活性剂：2）加入电解质：

37、如氯化钠、硫酸铵 3）吸附法：通过多孔性介质 4）高压电破乳： 5）加热 6）稀释法：,振动筛板塔,转盘萃取塔,常用的液-液萃取装置,三、超临界流体萃取,原理 利用超临界流体作为萃取剂，对物质进行溶解和分离.,应用 适用于脂肪酸、植物碱、醚类、酮类、甘油酯、芳香成分等物质的萃取分离。,1. 概述,什么是超临界流体： 一种流体在温度和压力分别超过其临界温度(tc)和临界压力(pc)时形成的超临界流体状态。 处于临界点状态的物质可实现液态到气态的连续过渡，两相相界面消失，汽化热为零。 超过临界点的物质，无论加多大的压力都不会液化，而只会引起密度变化。,超临界流体的特性,超临界流体溶解性强：密度接近

38、液体，比气体大数百倍，由于溶解度与溶剂的密度成正比，故具有与液体溶剂相近的溶解能力。 超临界流体扩散性能好：粘度接近气体，较液体小2个数量级。其扩散系数介于气液之间，故具有气体易于扩散和运动的特性，传质速率大大高于液体。 超临界流体性能易于调控：在临界点附近，压力和温度的微小变化，都可以引起流体密度很大的变化，使溶解度发生较大变化。,2. 超临界流体萃取的基本原理,利用超临界流体作为萃取剂，对物质进行溶解和分离,超临界流体的基本性质,常用的超临界流体,超临界流体萃取的过程：,超临界流体的形成 溶质在超临界流体中的扩散传质（萃取过程） 溶质与流体的分离。 与常规萃取相同之处： 利用物质在两相之间

39、的分配差异实现分离 差别： 萃取剂的特性不同,超临界流体萃取的方式,(1) 等温法 (2) 等压法 (3) 吸附法,三种典型流程,超临界萃取的影响因素,压力 温度 流体密度 容积比 颗粒度 夹带剂,1，co2萃取釜分离分离回路；2，co2萃取釜分离分离精镏柱回路；3，co2萃取釜精镏柱分离分离回路；4，co2萃取釜分离精镏柱分离回路。,优点 1.临界温度低，适用于热敏性化合物的提取和纯化。 2.可提供惰环境，避免产物 氧化，不影响萃取物的有效成份。 3.萃取速度快，无毒、不易燃，使用安全，不污染环境。4.无溶剂残留，无硝酸盐和重金属离子。,缺点： 高压下萃取，相平衡较复杂，物性数据缺乏； 高压

40、装置与高压操作，投资费用高，安全要求也高； 超临界流体中溶质浓度相对还是较低，故需大量溶剂循环； 超临界流体萃取过程固体物料居多，连续化生产较困难。,超临界co2 萃取特点,超临界流体萃取的应用,超临界流体萃取的工业应用,天然产物的萃取,液相萃取,固相萃取,1.co2储罐 2.高压泵 3.萃取釜 4，5，6.阀门 7，8，9.分离釜 10.回流阀,超临界co2萃取柑橘香精油的设备流程示意图,四、双水相萃取,双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相容性，当聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不互溶的两相。 因使用的溶剂是水，因此称为双水

41、相，在这两相中水分都占很大比例(85一95)，活性蛋白或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同比例分配于两相，这就克服了有机溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂的缺点。,系统的含水量多达75%-90%，两相界面张力极低(10-610-4n/m)，有助于保持生物活性和强化相际间的质量传递，也有易乳化的问题； 分相时间短（特别是聚合物/盐系统），一般只有5-15min； 易于连续操作； 目标产物的分配系数一般大于3，有较高收率； 分离过程更经济。,1. 双水相萃取的特点,常见的双水相体系,双水相萃取的主要影响因素,(1)与聚合物有关的因素 聚合物的种类、结构、分子量和浓度。 (2)与萃

42、取物有关的因素 电荷、大小、形状。 (3)与离子有关的因素 离子的种类、浓度和电荷。 (4)与环境有关的因素 体系的温度和ph值。,双水相萃取技术的工艺流程主要由三部分构成: 目的产物的萃取; peg的循环; 无机盐的循环。,双水相萃取的工艺流程,双水相萃取技术的应用,主要用于生物物质、药物的分离、提取、纯化等，如： (1)酶的提取与纯化 (2)核酸的分离及纯化 (3)药物和抗生素类的分离和提取 (4)病毒的分离及纯化 (5)从天然植物中提取有效药用成分,举例：,五、反胶束萃取,1. 反胶束和反胶束系统 反胶束是表面活性剂在有机溶剂中自发形成 的纳米尺度的一种聚集体。 本质仍然是液-液有机溶剂

43、萃取。 用途：氨基酸、肽和蛋白质的分离纯化,反胶束的形成,表面活性剂通常都有一个亲水的极性头和疏水的非极性尾。 当表面活性剂在有机溶剂中的浓度超过其临界胶束浓度后，其疏水的非极性尾向外伸入有机溶剂主体中，亲水的极性头则自发向内聚集排列成一个极性核。核中的空间具有溶解水和大分子的能力，称为池(pool)。 表面活性剂的临界胶束浓度(cmc)可通过表面活性剂手册查得，通常在110-4-110-3mol/l范围。,亲水极性头,疏水非极性尾,可游离离子,一种阴离子型表面活性剂,pool,反胶束的形成,形成原理,（1）溶液的ph ph影响蛋白质的电荷数量和电荷性质 （2）溶液的离子强度 影响微胶团的静电

44、状态 凡是对蛋白质所含电荷有影响的因素，如ph，以及对反胶束的静电状态有影响的因素，均能改变蛋白质的增溶作用。 （3）表面活性剂的浓度和种类 （4）其他（有机溶剂、助表面活性剂、温度）,影响反胶团萃取的因素,反胶束萃取技术的应用,(1)分离蛋白质混合物 如用二烷基磷酸盐/异辛烷反胶束溶液萃取 分离溶菌酶和肌红蛋白。 (2)浓缩-淀粉酶 如用tomac/异辛烷反胶束溶液萃取水相中的- 淀粉酶，以实现-淀粉酶的浓缩。 (3)直接提取细胞内酶 如用ctab/己醇-辛烷反胶束溶液直接从棕色 固氮菌细胞内提取胞内脱氢酶，既不破坏菌细胞，也可保持酶 的活性。 (4)从动植物资源中提取蛋白质 可利用反胶束溶

45、液直接从大豆、菜 籽、蚕蛹等残渣中提取分离有用的蛋白质。,第五节 膜分离技术,目录,1 膜技术概述 2 膜分离装置 3 极化、污染现象和控制 4 典型的膜分离技术及应用领域,1 膜技术概述,1.1 基本概念,所谓的膜，是指在一种流体相内或是在两种流体相之间有一层薄的凝聚相，它把流体相分隔为互不相通的两部分，并能使这两部分之间产生传质作用。 膜的特性： 不管膜多薄, 它必须有两个界面。这两个界面分别与两侧的流体相接触 膜传质有选择性，它可以使流体相中的一种或几种物质透过，而不允许其它物质透过。,膜(membrane)是什么？有何特性？,膜分离过程原理：以选择性透膜为分离介质，通过在膜两边施加一个

46、推动力（如浓度差、压力差或电位差等）时，使原料侧组分选择性地透过膜，以达到分离提纯的目的。通常膜原料侧称为膜上游，透过侧称为膜下游。,膜上游 透膜 膜下游,分离膜种类,分离膜,高分子膜的分离功能很早就已发现。1748年，耐克特（a. nelkt）发现水能自动地扩散到装有酒精的猪膀胱内，开创了膜渗透的研究。,1.2 膜分离技术发展简史,1861年，施密特（a. schmidt）首先提出了超过滤的概念。他提出，用比滤纸孔径更小的棉胶膜或赛璐酚膜过滤时，若在溶液侧施加压力，使膜的两侧产生压力差，即可分离溶液中的细菌、蛋白质、胶体等微小粒子，其精度比滤纸高得多。这种过滤可称为超过滤。按现代观点看，这种

47、过滤应称为微孔过滤。,然而，真正意义上的分离膜出现在20世纪60年代。1961年，米切利斯（a. s. michealis）等人用各种比例的酸性和碱性的高分子电介质混合物以水丙酮溴化钠为溶剂，制成了可截留不同分子量的膜，这种膜是真正的超过滤膜。美国amicon公司首先将这种膜商品化。,50年代初，为从海水或苦咸水中获取淡水，开始了反渗透膜的研究。 1967年，dupont公司研制成功了以尼龙66为主要组分的中空纤维反渗透膜组件。同一时期，丹麦dds公司研制成功平板式反渗透膜组件。反渗透膜开始工业化。,自上世纪60年代中期以来，膜分离技术真正实现了工业化。首先出现的分离膜是超过滤膜（简称uf膜）

48、、微孔过滤膜（简称mf膜）和反渗透膜（简称ro膜）。以后又开发了许多其它类型的分离膜。 在此期间，除上述三大膜外，其他类型的膜也获得很大的发展。80年代气体分离膜的研制成功，使功能膜的地位又得到了进步提高。,具有分离选择性的人造液膜是马丁（martin）在60年代初研究反渗透时发现的，这种液膜是覆盖在固体膜之上的，为支撑液膜。 60年代中期，美籍华人黎念之博士发现含有表面活性剂的水和油能形成界面膜，从而发明了不带有固体膜支撑的新型液膜，并于1968年获得纯粹液膜的第一项专利。 70年代初，卡斯勒（cussler）又研制成功含流动载体的液膜，使液膜分离技术具有更高的选择性。,1.3 膜的分类,1

49、)按膜的材料分类,表1 膜材料的分类,2)按膜的分离原理及适用范围分类 根据分离膜的分离原理和推动力的不同，可将 其分为微孔膜、超过滤膜、反渗透膜、纳滤膜、渗 析膜、电渗析膜、渗透蒸发膜等。 3)按膜的形态分类 按膜的形状分为平板膜(flat membrane)、管式膜(tubular membrane)和中空纤维膜(hollow fiber)。,4) 按膜的结构分类 按膜的结构分为： 对称膜(symmetric membrane) 非对称膜(asymmetric membrane) 复合膜(composite membrane),1.4 膜过滤的基础理论,通透量理论：一种基于粒子悬浊液在毛细

50、管内流动的毛细管理论。 水通量（jw）和截留率（r） w透水量，a膜的有效面积，时间 c1料液中溶质浓度， c2透过液中溶质浓度,1.5 膜分离过程的类型,分离膜的基本功能是从物质群中有选择地透过或输送特定的物质，如颗粒、分子、离子等。或者说，物质的分离是通过膜的选择性透过实现的。几种主要的膜分离过程及其传递机理如表2所示。,表2 几种主要分离膜的分离过程,续上表,1.6 膜材料,用作分离膜的材料包括广泛的天然的和人工合 成的有机高分子材料和无机材料。 原则上讲，凡能成膜的高分子材料和无机材料 均可用于制备分离膜。但实际上，真正成为工业化 膜的膜材料并不多。这主要决定于膜的一些特定要 求，如分

51、离效率、分离速度等。此外，也取决于膜 的制备技术。,目前，实用的有机高分子膜材料有：纤维素酯 类、聚砜类、聚酰胺类及其他材料。从品种来说， 已有成百种以上的膜被制备出来，其中约40多种已 被用于工业和实验室中。以日本为例，纤维素酯类 膜占53，聚砜膜占33.3，聚酰胺膜占11.7，其 他材料的膜占2，可见纤维素酯类材料在膜材料中 占主要地位。,1. 纤维素酯类膜材料 纤维素是由几千个椅式构型的葡萄糖基通过1, 4甙链连接起来的天然线性高分子化合物， 其结构式为：,从结构上看，每个葡萄糖单元上有三个羟基。 在催化剂（如硫酸、高氯酸或氧化锌）存在下，能 与冰醋酸、醋酸酐进行酯化反应，得到二醋酸纤维

52、 素或三醋酸纤维素。 c6h7o2 + (ch3co)2o c6h7o2(ococh3)2 + h2o c6h7o2 + 3(ch3co)2o c6h7o2(ococh3)3 + 2ch2cooh,醋酸纤维素是当今最重要的膜材料之一。 醋酸纤维素性能稳定，但在高温和酸、碱存在下易发生水解。 纤维素醋类材料易受微生物侵蚀，ph值适应范围较窄，不耐高温和某些有机溶剂或无机溶剂。因此发展了非纤维素酯类（合成高分子类）膜。,醋酸纤维素膜的结构示意图,99,表皮层，孔径 （810）1010m,过渡层，孔径 2001010m,多孔层，孔径 （10004000）1010m,1%,显微镜下膜的照片,2. 非纤

53、维素酯类膜材料 常用于制备分离膜的合成高分子材料有聚砜、聚酰胺、芳香杂环聚合物和离子聚合物等。,聚砜类树脂具有良好的化学、热学和水解稳定 性，强度也很高，ph值适应范围为113，最高使 用温度达120，抗氧化性和抗氯性都十分优良。因 此已成为重要的膜材料之一。,早期使用的聚酰胺是脂肪族聚酰胺，如尼龙 4、尼龙66等制成的中空纤维膜。这类产品对盐水 的分离率在8090之间，但透水率很低，仅 0.076 ml/cm2h。 以后发展了芳香族聚酰胺，用它们制成的分离膜，ph适用范围为311，分离率可达99.5（对盐水），透水速率为0.6 ml/cm2h。长期使用稳定性好。由于酰胺基团易与氯反应，故这种

54、膜对水中的游离氯有较高要求。,聚酰亚胺具有很好的热稳定性和耐有机溶剂能 力，因此是一类较好的膜材料。例如，下列结构的 聚酰亚胺膜对分离氢气有很高的效率。,离子性聚合物可用于制备离子交换膜。与离子 交换树脂相同，离子交换膜也可分为强酸型阳离子 膜、弱酸型阳离子膜、强碱型阴离子膜和弱碱型阴 离子膜等。在淡化海水的应用中，主要使用的是强 酸型阳离子交换膜。 磺化聚苯醚膜和磺化聚砜膜是最常用的两种离 子聚合物膜。,用作膜材料的乙烯基聚合物包括聚乙烯醇、聚 乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚偏氯乙 烯、聚丙烯酰胺等。共聚物包括：聚丙烯醇/苯乙烯 磺酸、聚乙烯醇/磺化聚苯醚、聚丙烯腈/甲基丙烯 酸酯、聚

55、乙烯/乙烯醇等。聚乙烯醇/丙烯腈接枝共 聚物也可用作膜材料。,常见材料的最高允许使用温度,无机膜多以金属及其氧化物、多孔玻璃、陶瓷为材料。从结构上可分为致密膜、多孔膜和复合非对称修正膜三种。,1.7 膜的制备,1. 分离膜制备工艺类型 膜的制备工艺对分离膜的性能十分重要。同样 的材料，由于不同的制作工艺和控制条件，其性能 差别很大。合理的、先进的制膜工艺是制造优良性 能分离膜的重要保证。 目前，国内外的制膜方法很多，其中最实用的 是相转化法（流涎法和纺丝法）和复合膜化法。,2. 相转化制膜工艺 相转化是指将均质的制膜液通过溶剂的挥发或 向溶液加入非溶剂或加热制膜液，使液相转变为固 相的过程。相

56、转化制膜工艺中最重要的方法是ls 型制膜法。它是由加拿大人劳勃（s. leob）和索里 拉金（s. sourirajan）发明的，并首先用于制造醋 酸纤维素膜。,将制膜材料用溶剂形成均相制膜液，在模具中 流涎成薄层，然后控制温度和湿度，使溶液缓缓蒸 发，经过相转化就形成了由液相转化为固相的膜， 其工艺框图可表示如下：,图 ls法制备 分离膜工艺流程框图,3. 复合制膜工艺 由ls法制的膜，起分离作用的仅是接触空气 的极薄一层，称为表面致密层。它的厚度约0.25 1m，相当于总厚度的1/100左右。理论研究表明可 知，膜的透过速率与膜的厚度成反比。而用ls法 制备表面层小于0.1m的膜极为困难。

57、为此，发展 了复合制膜工艺，其方框图如图3所示。,图 复合制膜工艺流程框图,1.8 膜的保存,分离膜的保存对其性能极为重要。主要应防止 微生物、水解、冷冻对膜的破坏和膜的收缩变形。 微生物的破坏主要发生在醋酸纤维素膜； 而水解和冷冻破坏则对任何膜都可能发生。温度、ph值不适当和水中游离氧的存在均会造成膜的水解。冷冻会使膜膨胀而破坏膜的结构。,膜的收缩主要发生在湿态保存时的失水。收缩变形使膜孔径大幅度下降，孔径分布不均匀，严重时还会造成膜的破裂。当膜与高浓度溶液接触时，由于膜中水分急剧地向溶液中扩散而失水，也会造成膜的变形收缩。,2 膜分离装置,将膜、固定膜的支撑材料、间隔物或管式外壳等组装成的

58、一个单元称为膜组件。膜组件的结构及型式取决于膜的形状,工业上应用的膜组件主要有中空纤维式、管式、螺旋卷式、板框式等四种型式。管式和中空纤维式组件也可以分为内压式和外压式两种。,膜组件(membrane module),(1)、板框式(plate-and-frame)膜组件 板框式是最早使用的一种膜组件。其设计类似于常规的板框过滤装置, 膜被放置在可垫有滤纸的多孔的支撑板上,两块多孔的支撑板叠压在一起形成的料液流道空间,组成一个膜单元,单元与单元之间可并联或串联连接。不同的板框式设计的主要差别在于料液流道的结构上。,(2)、管式(tubular)膜组件 管式膜组件有外压式和内压式两种。对内压式膜

59、组件,膜被直接浇铸在多孔的不锈钢管内或用玻璃纤维增强的塑料管内。加压的料液流从管内流过,透过膜的渗透溶液在管外侧被收集。对外压式膜组件,膜则被浇铸在多孔支撑管外侧面。加压的料液流从管外侧流过,渗透溶液则由管外侧渗透通过膜进入多孔支撑管内。无论是内压式还是外压式,都可以根据需要设计成串联或并联装置。,(3)、螺旋卷式(spiral wound)膜组件 目前,螺旋卷式膜组件被广泛地应用于多种膜分离过程。 膜、料液通道网、以及多孔的膜支撑体等通过适当的方式被组合在一起,然后将其装人能承受压力的外壳中制成膜组件。通过改变料液和过滤液流动通道的形式,这类膜组件的内部结构也可被设计成多种不同的形式。,(4

60、)、中空纤维(hollow fiber)膜组件 中空纤维膜组件的最大特点是单位装填膜面积比所有其他组件大, 最高可达到30000m2/m3。中空纤维膜组件也分为外压式和内压式。将大量的中空纤维安装在一个管状容器内,中空纤维的一端以环氧树脂与管外壳壁固封制成膜组件。料液从中空纤维组件的一端流人, 沿纤维外侧平行于纤维束流动,透过液则渗透通过中空纤维壁进入内腔,然后从纤维在环氧树脂的固封头的开端引出,原液则从膜组件的另一端流出。,各种膜组件的传质特性和综合性能的比较分别见下表。,3 浓差极化、污染现象和控制,浓 差 极 化 定 义,在膜分离操作中，所有溶质均被透过液传送到膜表面上，不能完全透过膜的