胚胎冷冻保存（专业知识）

1、胚 胎 冷 冻 保 存,1,稻谷课件,将胚胎贮存在196超低温下长期保存的方法。这是20世记70年代试验成功的一项新技术，是胚胎移植技术的重大突破。,胚胎冷冻保存的基本概念,2,稻谷课件,胚胎冷冻保存的意义,胚胎移植不受时间和地点的限制，提高了胚胎移植技术的效率； 长期保存优良母牛基因最可靠的技术措施； 便于国际间交流； 替代种畜引种。,3,稻谷课件, 渗透性：甘油、乙二醇（EG）、丙二醇（PG）和DMSO等，防止溶质效应。 非渗透性：蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、PVP和聚蔗糖等，降低胚胎外液的冰点，减少胚胎外冰晶形成，并能促使胚胎内部的水分外流，从而最终减少胚胎内部冰晶的形成。 基础液： mPB

2、S（改良）、 TCM-199、PBS、HEPES等，最常用mPBS。,抗冻剂的种类及作用,特点：分子量小于100，易于渗透,特点：分子量大，不进入细胞,4,稻谷课件,玻璃化的概念：是一种物理现象，指通过快速降温越过冰晶形成的阶段，不发生结晶即可固化，使溶液形成一种无规则结构的稳定玻璃样固体，且保持液态时正常的分子和离子分布，则胚胎细胞免受损伤。 即高浓度的抗冻剂，急速冷却后，液体的黏性增加，冰晶不能形成，由液态变为透明半固态的现象。 玻璃化溶液（VS）： 细胞内液抗冻剂：这种抗冻剂分子量小，容易透过细胞膜，使其内部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二甲基亚砜、甘油、丙二醇，

3、乙酰胺及乙二醇等。 细胞外液抗冻剂：这种抗冻剂分子量较大，一般很难透过细胞膜，所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSA）等。 上述两种抗冻剂组合后，用基础液mPBS调制成各种玻璃化溶液。,抗冻剂的种类及作用,5,稻谷课件, 结晶变化： 温度降至冰点时，冰晶首先在胚胎外液形成。温度、冰晶和外液的溶质浓度，迫使胚胎内部的水不断外流，胚胎内部溶质浓度增加。 溶质效应： 降温速度太慢，胚胎内水充分外流，溶质浓度极度增加，细胞膜的脂蛋白复合物和胞质内的一些其他功能蛋白变性，造成对胚胎的不可逆损害。 机械效应： 降温速度过快，胚胎内部的水来不及溢出到胚

4、胎外面而直接在胚胎内部形成冰晶，从而对胚胎造成致命的机械损伤。,胚胎冷冻保存过程中的变化和损伤,6,稻谷课件, 常规冷冻法：“植冰”后控制降温速度，避免过快以免胚胎内部形成大块冰晶；避免过慢，以免胚胎过分脱水而产生溶质效应。 超速冷冻法：非渗透性防冻剂对胚胎进行冻前脱水处理，将胚胎平衡一段时间，而后投入液氮保存。 玻璃化冷冻法：应用高浓度防冻剂，使胚胎内外液的同源晶核形成温度与玻璃态转化温度基本接近，控制防冻剂与胚胎的平衡时间和温度，使防冻剂对胚胎毒性降低到最低程度。胚胎内外液能迅速转化形成玻璃体，直接投入液氮保存。,胚胎冷冻保存方法,7,稻谷课件,历史：1972年首先获小鼠胚胎冷冻成功； 1

5、973年牛的胚胎冷冻后获得成功，并产下后代。 操作流程： （1）抗冻液中平衡：室温下（2025），在含有12摩尔升抗冻剂的磷酸缓冲液（PBS）中，胚胎经10分钟平衡，使细胞内部抗冻剂浓度基本达到饱和。,常 规 冷 冻 法,8,稻谷课件,（2）植冰（诱发结冰）： 植冰的概念：在液氮中冷却后的镊子或棉签夹住塑料细管上端（棉栓端），使抗冻液迅速通过6左右冰点，强制性地使细胞外液形成冰晶，称之为植冰。 目的：当温度降到抗冻液冰点附近时，经植冰迅速冻结，以防胚胎细胞内部产生冰晶，给胚胎造成物理性的损伤，致使胚胎死亡。 将胚胎移入事先配置好抗冻液的0.25毫升塑料细管内封口后进行冷却。当温度降至6左右时，

6、用上述方法诱发结冰。,常 规 冷 冻 法,9,稻谷课件,（3）自动降温仪中缓慢降温：植冰后的细管按一定速度缓慢降温。 以0.33分钟降至3035时投入液氮； 以1.0分钟的速度降至80时投入液氮； 以0.5分钟降至3035时投入液氮。 原理：植冰后使细胞外液浓度相对增高，促使细胞内部水分充分脱出，因此缓慢降温是非常必要的。由于脱水使细胞内部充分收缩，同时抗冻剂渗透到细胞内部使内部溶液黏性增大，这时投入液氮中，由于过冷抑制冰晶形成。,常 规 冷 冻 法,10,稻谷课件,（4）解冻：贮存在液氮中的塑料细管取出后，迅速浸入室温或37水浴中解冻。 （5）除去抗冻剂： 原因： 解冻后的胚胎，细胞内部抗冻

7、剂浓度较高，对胚胎有毒害作用；此外，若直接移入等渗生理溶液中，水分会伸入细胞内引起膨胀，使细胞受损伤。 抗冻液：蔗糖溶液； 操作：解冻后胚胎由浓度高的抗冻液中移向浓度低的抗冻液，进行梯度稀释；即将胚胎先移入高渗蔗糖溶液中，再移入低渗蔗糖溶液中，在脱水的同时脱出抗冻剂，而后移入等渗生理溶液中洗净，待胚胎基本复原后进行移植或继续培养。,常 规 冷 冻 法,11,稻谷课件,从培养液中吸取胚胎，并放置在冷冻液中: 1.5M 乙二醇 + 蔗糖 + PBS + AA + FCS 装入细管 (编号预先准备好) 放入冷冻容器 -6.0 Seeding ice 每分钟降低 0.5 ，一直到-30为止 放入液氮容

8、器,常 规 冷 冻 程 序,12,稻谷课件,玻璃化的概念：是一种物理现象，指通过快速降温越过冰晶形成的阶段，不发生结晶即可固化，使溶液形成一种无规则结构的稳定玻璃样固体，且保持液态时正常的分子和离子分布，则胚胎细胞免受损伤。 即高浓度的抗冻剂，急速冷却后，液体的黏性增加，冰晶不能形成，由液态变为透明半固态的现象。 玻璃化溶液（VS）： 细胞内液抗冻剂：这种抗冻剂分子量小，容易透过细胞膜，使其内部迅速达到玻璃化所需要的浓度，所以称为细胞内液抗冻剂。如二甲基亚砜、甘油、丙二醇，乙酰胺及乙二醇等。 细胞外液抗冻剂：这种抗冻剂分子量较大，一般很难透过细胞膜，所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、

9、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白（BSA）等。 上述两种抗冻剂组合后，用基础液mPBS调制成各种玻璃化溶液。,胚胎玻璃化冷冻,13,稻谷课件,几种常见的玻璃化冷冻方法： （1）Rall等（1985）玻璃化冷冻保存法：是最初发明的玻璃化冷冻保存方法，他们采用的VS1玻璃化溶液，是以透过性抗冻剂二甲基亚砜（DMSO）为主体溶液，为缓和其化学毒性，添加了乙酰胺(AA)、丙二醇(PG)和非透过性抗冻剂聚乙二醇(PEG)。PEG具有促进玻璃化形成的作用。胚胎在玻璃化溶液中平衡时，浓度由低到高（2550100VS1）；平衡温度由高到低（2244）三步完成，计35分钟平衡后投入液氮中冷冻保存。,胚

10、胎玻璃化冷冻,14,稻谷课件,（2）Scheffen等玻璃化冷冻保存法： 主体抗冻剂：丙三醇（G）和丙二醇(P)； 玻璃化溶液：上述两种抗冻剂各含25混合而成(PG25)，两者混合后可降低溶液的化学毒性，无需添加细胞非透过性抗冻剂。 方法：室温下（2025），胚胎于10丙三醇溶液中平衡10分钟，然后在PG25中平衡30秒钟，然后投入液氮中冷冻保存。,15,稻谷课件,（3）Kasai等玻璃化冷冻保存法： 抗冻剂：乙二醇（EG）为细胞内液抗冻剂（透过性保护剂），其具备分子量小、溶液渗透压高、细胞膜透过性强的特点；聚蔗糖（Ficoll）为细胞外液抗冻剂，有利于促进玻璃化形成；蔗糖(Sucrose)是

11、为了冷冻前胚胎细胞的脱水，细胞内部EG的调整及解冻后的EG的脱出。 玻璃化溶液：上述三种抗冻剂经mPBS调整成EFS玻璃化溶液； 方法：室温胚胎在EFS玻璃化溶液中25分钟平衡后，即投入液氮。,胚胎玻璃化冷冻,16,稻谷课件,（2）Zhu等玻璃化冷冻保存法： 主体抗冻剂：乙二醇、甘油和二甲基亚砜； 玻璃化溶液：EFS、GFS和EDFS； 方法：室温下，将胚胎在10乙二醇或10甘油或10乙二醇10二甲基亚砜中平衡5分钟，再移入EFS或GFS或EDFS玻璃化溶液中平衡30秒钟，即两步法冷冻保存。此方法重复性较高，对实验动物及各种家畜的胚胎皆可进行冷冻保存。,胚胎玻璃化冷冻,17,稻谷课件,胚胎细管编号,胚 胎 细 管 编 号,18,稻谷课件,胚胎装管,19,稻谷课件,保护细胞膜免受损害； 保护胚胎细胞，免受晶体损害； 具有“渗透活性”； 解冻后保护剂必须从细胞内去掉； 甘油（丙三醇）：普通的冷冻和解冻剂，通过细胞膜慢慢扩散，为避免渗透休克，必须缓慢去掉； 乙二醇 ：直接胚胎移植方法, 通过细胞膜快速扩散， 因而不需要慢慢去掉。,冷冻保存的要点,20,稻谷课件,胚 胎 解 冻,解冻方法： 慢速解冻：以4-25/min的速率使胚胎由冷冻保存温度逐渐升至室温，适用于慢速冷冻的胚胎。当温度由-196 升到-50-15 埋，细胞内仍可能形成大冰晶而致死胚胎。 快速解冻：温