三 细胞工程(实用课件)

1、,三 细胞工程(实用课件),2,一、概述,问题：1、什么是细胞？什么是细胞工程？ 2、发展简史如何？ 3、细胞工程的基本技术是什么？,3,1、什么是细胞？什么是细胞工程？,细胞：是由细胞质膜包裹着的细胞质和核或核带组成的，能自我繁殖的结构物，是生物体的基本结构单位和功能单位，是生命孕育的起点，是生物体的基本组成单位。 Cell engineering:根据生物学和工程学的原理，在细胞水平上定向改造细胞的遗传物质，培育具有新性状的生物个体或细胞群体，并利用它们为人类生产各类药品和其他产品以及提供服务的技术体系。,4,2、发展简史如何？,1）1838（最早）马勒，在脊椎动物的肿瘤细胞中观察到多核现

2、象 2）1849-1858年 科学家们在肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核现象。 3）1859年，A.巴里解开了这个谜团，他认为“多核现象”是由“单个细胞融合”而成的。 4）到了1907年哈林发现了细胞培养的方法。使人们能应用这种细胞培养技术。 5）1965年哈里斯和奥金斯在前人的基础上在细胞融合中所做的贡献 。,5,6）直到1960年，英国诺丁汉大学科金教授创造性地应用酶解的方法，才首次成功地从番茄幼苗的根部制备到大量的原生原体。在此基础上，1972年美国的卡尔森等人用 NaBO3作为融合的诱导剂，将来自不同种的两个烟草原生质体进行融合，获得世界上第一个体细胞杂种植株。此后，分

3、别以凯乐、高国楠和乔默尔曼等为首的三个科学家小组，从不同方面改良和发展了植物体细胞融合技术。目前常用的植物细胞融合技术，有高国楠建立的使用化学融合剂PEG（聚乙二醇）的融合技术（1974），森达和乔默尔曼创立和发展的电融合技术，以及斯维格（1978）将电融合体系培养技术。近年来，在植物细胞融合研究方面的突出进展是建立了单对细胞融合体系培养技术，并基本上解决了融合细胞的选择问题。现在，植物原生质体及其应用的研究已成为植物细胞工程中最活跃的研究领域之一。,6,3、细胞工程的基本技术是什么？,细胞的培养技术：是将生物体的某一部分组织取出一小块，在体外进行表面消毒处理后，使之分散成单个游离的细胞，并放

4、置在人工配制的培养基中进行培养，使之生长分裂的技术。 由于生物体的一种组织，往往包含有两种以上的细胞，如叶片组织至少年犯含有叶肉细胞，维菅束鞘细胞和表皮细胞在培养过程中不易分开，所以细胞培养有时叫组织培养或统称为细胞与组织培养。,7,细胞的培养技术的意义,细胞的培养技术不仅是细胞工程的一项基本技术，也是生物工程的一项基础技术，掌握了细胞的培养技术，就可以利用细胞的遗传稳定性和变异性为细胞生物学的基础理论研究和生物工程的生产应用提供用力的手段。 例：1、研究者可以根据不同的研究内容和目的，十分方便地在细胞培养基中添加或减少某些特殊的物质，如激素或生长因子等，这样就可以确切了解这些因子对细胞生长发

5、育的效应及其生理生化本质；,8,细胞的培养技术的意义,2、可以获得比较均一的细胞群体，为基因工程和细胞工程提供遗传的对象和受体获得变异细胞株，以应用于遗传学和遗传工程研究、代谢与发育过程及其调节的研究，获得有用价值的或具有新型生物或细胞系； 3、建立种质资源库，保存具有重要价值的或濒临灭绝的生物种类； 4、生产各种有用的化合物（药物）； 5、进行无性系快速繁殖等。,9,细胞融合技术（也称细胞杂交技术）：细胞融合技术是60年代创立的。它是在一定条件下，使不同来源的两个或多个细胞合为一个细胞并增殖或形成新的生物体的技术。 动物细胞无细胞壁，可直接诱导融合； 植物细胞进行融合时，必须先除去细胞壁。

6、意义：动物细胞融合技术的成功，导致了淋巴细胞 杂交瘤技术的出现，植物融合技术的成功不仅打破了杂交育种的亲和性障碍，而且为实现“超远缘杂交”提供了可能，因此在植物育种上有重大工的意义。,10,二、动物细胞工程,问题：1、什么是动物细胞工程？研究的内容是什么？ 2、动物细胞工程技层次如何？ 3、动物细胞工程有何理论与实践意义？ 4、动物细胞培养有何特征？,11,1、什么是动物细胞工程？研究的内容是什么？,动物细胞工程：是根据细胞生物学及工程学的原理，利用生物技术对动物细胞进行遗传操作，定向改造动物的遗传性，创造新的物种，以及从动物组织中分离有特定的功能的细胞并通过工程化在体外条件下使之快速繁殖，产

7、生特定生物产品的工艺。,12,内容： 人工受精（体外受精） 胚胎移植 核移植 哺乳动物孤雌生殖 双胞及嵌合体 性别选择 胚胎分割及保存,细胞融合 细胞大规模培养 动物细胞大规模培养 动物细胞反应动力学 动物细胞反应器 主要研究内容。,13,2、动物细胞工程技层次如何？,遗传操作可在不同层次上进行： 1）、在整体细胞水平上，利用细胞培养的各种工艺对细胞进行改造或用细胞融合的方法制备各种杂种细胞； 2）、在细胞器水平上，可以进行核移植，染色体注射或将微核人工细胞等进行融合以制备各种细胞质体，或改变染色体的组成倍性； 3）、在基因水平上，有采用外源基因导入的方法，赋予细胞以新的特征和新的功能。,14

8、,4）、通过制备全能性的胚胎干细胞，经过遗传操作进而把它种植到假孕动物的子宫里孕育成动物以培育出新品种。 理论与实践意义：哺乳动物细胞是生产许多有着重要经济价值的医药产品的理想场所：它具有促进蛋白质精确表达与形成三维结构的内环境，能进行乙基化、二硫键等；它所产生的蛋白质能分泌到细胞外，具有完全正常的蛋白质的结构。因此用动物细胞工程生产的产品，其分离纯化的程序比工程菌生产的产品要简单得多，而且功能也可靠得多；另外通过动物细胞工程，还可以研究诸如细胞衰老调亡，基因定位遗传病因等基础理论问题。,15,4、动物细胞培养有何特征？,4、动物细胞培养特征。 根据这些特点，我们在培养动物细胞时必须注意什么问

9、题呢？ 1）、培养时要用抗生素；（细胞生长缓慢，易染菌）； 2）、不能也不需要进行强力通风或搅拌（无细胞壁，很脆弱，需氧量少）； 3）、有的细胞不能用悬浮培养法（有锚地依赖性）； 4）、在进行单细胞培养时，往往需要使用条件培养基（有群体效应）；,16,5）、一般不用于生产价格低廉的产品（培养成本较高）； 6）、大规模培养时不能全用微生物反应的经验（生长曲线不一样，反应动力学也不同，有的需贴壁生长）； 7）、经过一段时间的培养后，就必须进行传代（随着细胞生长，营养物质消耗，必然产生乳酸等代谢产物的积累，引起细胞衰亡，但一般繁殖50代即退化死亡，肿瘤细胞除外）。,17,5、动物细胞的营养需求及培养

10、基,动物细胞所需的营养要求更高，更复杂。主要表现在： 1）、C源不能用无机盐，而大多数为葡萄糖； 2）、N源不能用无机物（如氨、硝酸盐等），而主要是各种氨基酸； 3）、要添加百分之520的小牛血清或动物胚胎浸出物。,18,用于培养动物细胞的培养基分为： 维持液和生长液。 相同点：都含有氨基酸、葡萄糖、核酸类物质、维生素、辅酶、激素、生长因子、微量元素、缓冲系统。 不同点：一是血清含量不同。维持液含量低或者不含血清，生长液含百分之520血清。二是用途不同。维持液主要用来保存细胞，而生长液用于培养、增殖细胞。,19,6、动物细胞培养技术,问题：什么是动物细胞培养技术？ 动物细胞培养技术的材料来源如

11、何？ 动物细胞培养方式如何？ 动物细胞培养方法如何？,20,动物细胞培养技术：在一定条件下，通过人工供给营养物质及生长因子使离体动物细胞或组织生长繁殖的方法。 如果是培养的材料是组织块，则称为组织培养。 材料：一是胚胎。如10日12日龄的鸡胚胎，实验动物胚胎及人工流产胎儿。 优点是胞间的粘连作用较弱，易于消化与分散，细胞生命力强，易于培养与繁殖。 二是成体组织和器官。如动物的肝脏、肾脏、脾脏及白血球等。优缺点是与胚胎相反。但肿瘤细胞增殖力强，可在体外长期培养和繁殖，并可用微生物培养方式进行悬浮培养。,21,培养方式：一是非贴壁培养。这种方法一般用于血液、淋巴细胞、肿瘤细胞（杂交瘤细胞）和一些转

12、化细胞的培养，可采用悬浮培养法。 二是贴壁培养。在多数的动物细胞，包括非淋巴组织的细胞，多采用附着于带适量正电荷的固体或半固体表面进行培养。 培养方法 ：,22,1）、组织块培养法：将动物组织切成12立方毫米小块进行培养的方法 。 2）、细胞单层培养法： 问题：什么是原代培养？什么是原代细胞？什么叫传代培养（继代培养）？ 什么是细胞系？什么是细胞株？两者之间的关系如何？,23,细胞单层培养法：动物组织块经消化分散成单个细胞或细胞团块后，粘附于培养容器表面培养成新生细胞单层的培养方法。 细胞分散：实现细胞单层培养及克隆培养，需将组织中粘连在一块的细胞分散成单个细胞。有酶消化法、物理分散法和酶消化

13、与物理分散结合法。 细胞培养：细胞悬浮液经计数与稀释后，接种于无菌培养容器中，加生长液，细胞就粘附于瓶底内壁在37。C下培养，细胞就开始生长并形成单层。,24,这一培养过程称为原代培养。 原代培养获得的细胞称为原代细胞。 原代细胞经过一段时间的培养后，需要将培养瓶中的细胞（单层）用胰蛋白酶消化，制成细胞悬浮液，再分装到两个或两个以上的培养瓶中培养。这个过程 就称传代培养（继代培养也细胞传代）。 原代细胞经过 第一次传代所得到的细胞群称为细胞系。 从原代细胞或细胞系中获得的能连续传代、有特殊性质或特殊标记的细胞称为细胞株。,25,两者的关系：细胞系是由来自原代培养的许多细胞世代所组成的，而细胞株

14、则需具有特殊性质或标记，并能在培养传代中长期保存（能稳定遗传），一旦失去为些特殊性质或标记，细胞株又回到细胞系。 3）、单细胞分离培养法：也称细胞克隆培养、是将动物组织分散后，使其单个细胞培养成纯系集体的技术。 由于动物细胞具有群体效应，因此要想将单个细胞培养成一个克隆相当难，即使在最优良的培养基中单个细胞也很难生长，那怎么办呢？常用两种方法：,26,一是采用条件培养基。即生长过悬浮细胞的培养液，其中含有能促进细胞正常生长和分裂的内源代谢物； 二是在培养基中加饲养细胞，如小鼠胸腺细胞或腹腔细胞。 为了满足这些条件要求，通常采用有限稀释法和微板克隆技术。 所谓有限稀释：就是细胞悬浮液经过计数后，

15、根据需要稀释到一定的细胞 浓度。,27,微板克隆技术：是利用微量板进行克隆培养的技术。 微量板是指孔径为6mm，容量为0.3ml的多孔培养板。通常有96孔、55孔、和24孔三种规格。 培养方法： 优点：是分离混杂细胞的优良方法。在传代过程中，由于不容易产生交叉混杂，故单细胞培养的可靠性与重复性良好。 用途：1）、建立纯细胞系； 2）、检查细胞遗传一致性； 3）、分离细胞变种（细胞株）；,28,4）、评价药物及毒物对细胞生长的影响； 5）、筛选淋巴细胞杂交瘤及基因工程细胞； 6）、制备单克隆抗体并用于病毒学研究。,29,7、动物细胞大规模培养,问题：1）、动物细胞大规模培养指的是什么？ 2）、为

16、什么要进行动物细胞大规模培养？ 3）、动物细胞大规模培养首先要解决的难题是什么？为什么？,30,动物细胞大规模培养指的是工业大规模。 在规模培养技术：是指在人工控制的条件下，高密度大量培养有用的动物细胞来生产生物制品的技术。 这种技术是目前生物工业中大量增殖基因工程、细胞融合或株化所形成的新型有用细胞不可缺少的技术。 要解决动物细胞大规模培养，首先要解决的一个难题是培养基。,31,原因：一是血清来源难而昂，大量使用必然增加产品成本； 二是血清产地、批号及动物个体不同，其质量差异很大，加上血清的组成还没有完全搞清楚，因而细胞培养过程难以检测控制，难以保证结果的可重性； 三是血清中含有多种（大量）

17、的蛋白质，从而给产品分离纯化带来许多困难，容易混进污染物包括病毒和细菌。 对于这种情况，人们自然提出这样的问题，能不能不用血清或者能不能用别的东西来代替血清？,32,要回答这个问题，首先必须搞清楚血清在动物细胞培养中起到什么样的作用？ 研究表明：在合成动物培养基中加入胎牛血清或小牛血清，主要是利用其中含有的血清蛋白及a-球蛋白两种成分。 血清蛋白能刺激细胞生长； a-球蛋白能促进细胞贴壁伸展及拮抗胰蛋白酶的活力，保证经胰蛋白酶消化后的细胞能正常生长。 搞清了这个问题后，我们才有可能来开发无血清培养基。目前这项工作已经成为动物细胞工程的重要内容之一。,33,无血清培养基分为： 基本培养基：是已知

18、成分的培养基，大多数以DME培养基与HamF12培养基等量混合。 基本合成培养基+生长因子（激素和维生素等约有30多种有机物和无机微量物质，包括哺乳动物绝大多数内分泌激素）。 基本合成培养基+组织抽提液（如乳蛋白水解液、酪蛋白水解物和胚胎浸出液）。,34,现在用的最多的是第二种，也称为添加生长因子培养基，它的特点是：组成物质的种类与数量均为已知，并可按需要调节。 优点：一是可用于培养不同种类的细胞及在不含血清培养基中不能生长的细胞； 二是可用于杂种细胞、基因工程细胞及突变体细胞的培养，生产有用物质； 三是大大简化细胞培养产物分离纯化的操作程序。,35,能起血清作用的激素和生长因子主要有： 铁传

19、递蛋白、乙醇胺、胰岛素、促胃激素、维生素C、氢化考的松和硒等。 培养技术与其条件控制： 动物细胞培养方法很多，但可概括为两大类即悬浮培养法和固定化培养法。微载体培养法是两者结合而衍生出来的。 下面简单介绍悬浮培养法： 定义：即让细胞在培养液中呈现悬浮状态下生长繁殖。 其培养方式又有批量法、半连续法及连续法。,36,适用范围：杂交瘤细胞、肿瘤细胞、血液细胞和淋巴细胞的大规模培养。主要用于生产疫苗、r-干扰素、白介素及单克隆抗体等生物药品或制品。 优点：可连续收集部分细胞进行移植继代培养，传代培养时无需消化分散，免受酶类、EDTA及机械损害；细胞必集率高，并可连续测定细胞浓度，还可能实现大规模直接

20、克隆培养。 但此法不适用于正常组织细胞的培养。,37,动物细胞大规模培养的工艺流程：,38,39,8、胚胎干细胞系的建立及其利用技术,概述 ：,40,41,问题：什么是胚胎干细胞？ 胚胎细胞有何特征？ 胚胎干细胞如何获得？如何培养？ 胚胎干细胞如何发育成个体？,42,胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell 简称ES）：是从早期胚胎的内细胞团分离出来的，能在体外培养的一种高度末分化的细胞。,43,44,45,胚胎细胞的特征： 一是具有正常二倍染色体； 二是具有发育的全能性（一个细胞，都包含有某个体的全部遗传信息，在离体培养条件下能生长为完整的个体）广泛地分化成各种组织； 三是能在体外

21、扩增，可进行遗传操作，选择、克隆和冻存。,46,胚胎干细胞获得有两条途径： 一是从早期胚胎中获得； 二是结合克隆技术获得。 胚胎干细胞的培养： 由于大多数胚胎干细胞必须生长在滋养层细胞上，体外培养时，培养皿需要百分之0.1明胶铺底，常用STO细胞为滋养细胞（即小鼠胚胎成纤维细胞）。,47,48,STO的特征：具有接触抑制，它能分泌一些促使细胞生长 和抑制细胞分化的因子或某些细胞外基质，使胚胎内细胞团能在比较稳定的环境中生长并保持末分化状态。 胚胎干细胞是否培养成功在于： 一是胚胎发育的精细阶段； 二是要从单个胚胎中获得足够量的具有多能干细胞的前体细胞； 三是培养条件和培养方式。,49,目前，E

22、S技术实用化还需要解决的技术难题还用很多，主要表现在： 一是胚胎干细胞极易分化为其它细胞，如何维持体外扩增时不发生分化？ 二是如何定向诱导干细胞分化？ 三是由ES在体外发育成一完整的器官特别是像心、肝、肾、肺等大型精细复杂的器官这一目标，还需要技术上的突破； 四是如何克服移植排拆反应。,50,（二）、动物细胞融合技术及其应用,1、动物细胞融合技术： 定义：在外力作用下，使两个或两个以上的异源细胞合并为一个多核细胞的过程。 操作过程 ：,51,52,意义： 是用人工的方法打破了生物界物种间的屏障，使人们能够按照自己的意愿把各种动物的、植物的、动植物的不同组织类型的细胞融合在一起；还可以把不同细胞

23、的不同组分，胞核和胞质体，单个染色体或少数染色体，不同胞浆成分，通过微核、人工细胞、类脂小泡等彼此融合，而制备各种类型的重组细胞。 用来融合的体细胞一般都是已分化的二倍体细胞。融合形成四倍体细胞。这种细胞是人类强制自然的结果，因此产生了很少发生的杂种细胞。,53,2、促融因素及其诱导融合作用,1）、病毒诱导融合： 2）、PEG诱导融合： 3）、电场诱导融合：,54,3、细胞融合的方式,1）、完整细胞之间的融合： 2）、核体、胞质体与完整细胞的融合： 3）、微细胞与完整细胞的融合： 4）、脂质体介导的细胞融合： 这四种融合方式，共同点均有一方为完整细胞，这个完整细胞可用于检测另一种细胞、细胞器及

24、生物大分子对其遗传性及表达的影响。所以这个完整细胞相当于一个活试管或微型反应器。,55,4、杂种细胞的筛选原理及筛选系统,筛选杂种细胞是细胞融合过程中最重要环节之一。杂种细胞在总体细胞中为数较少，因此在进行细胞融合之前就必须先设计如何把杂交细胞从众多的细胞群体中筛选出来，筛选的目的是获得性能优良的杂种细胞。,56,57,筛选的原理：将融合混合物接种于选择性培养基上，终止同核多型、异核多型及末融合的亲本细胞的繁殖，而仅允许异型双核细胞繁殖。 在动物细胞的融合过程 中，需要根据筛选系统来选择适当的亲本细胞或依据细胞的生理生化特性来设计特定的筛选系统，以便于获得具有活力的有益杂种细胞。,58,筛选的

25、方法： HAT选择系统：含一定浓度的次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基。它们与细胞DNA合成有关。,59,60,61,抗药性选择系统：利用生物细胞对药物敏感性的差异来筛选杂种细胞。细胞不同，其生理生化特征不一样，对同一种药物的敏感性差异 很大。 互补选择法：利用两种亲本营养缺陷型互补原理来筛选杂种细胞的方法。 原位杂交法和基因探针选择法前面已介绍过。,62,5、细胞融合技术的应用,理论上：基因定位及绘制人类基因图， 基因互补分析； 应用上：主要是生产活性物质。,63,（三）、单克隆抗体技术,1、概述： 2、基本原理： 3、经典的方法获取抗体存在以下缺点： 一是这些抗体不是均匀的，而是多种抗体的混合物。特异性差、检测灵敏度低、使用效果不好； 二是由于动物个体差异而导致各批血清内抗体的种类与含量不一，无法标准化； 三是由于分泌抗体的B细胞寿命很短，一般只能存活几天，因此抗体的产生是有限的，无法大量生产。,64,4、杂交瘤技术：将骨髓瘤细胞与免疫细胞融合制备杂交细胞的过程 。 通过这样的技术得到的杂交瘤细胞具有了两组亲本细胞的遗传特征。能在体外长期培养，快速无限繁殖的能力，又有免疫反应和分泌抗体的能力。 单克隆抗体：由一个杂交瘤细胞克