反应分离耦合技术生产Ｌ－苹果酸工艺过程优化及酶反应动力学的研究

1、反应分离耦合技术生产工一苹果酸工艺过程优化及酶 反应动力学的研究胡永红欧阳平凯陈武领蔡兴怀 (南京化工大学生物工程与科学系南京210009)摘要研究了采用游离延胡索酸酶，利用生轴反应分离耦舍原理，富马酸钙为底物，在延胡 素酸酶的作用下，直接生成苹果酸钙_ii法相对目前广泛采用的固定化方法具有工艺流程短操 作简便转化率及收率高等特点研究结果表明在转化温度为40c、pit为7o一75时，每升 酶延胡索酸酶洼能在20一28h间将32kg的言马赣钙转化生成苹果酸钙，其转化率高速999 富马酸在产品中的残留在01左右，谊工艺生产出的上一苹果酸产品符合美国药其标准，成本于化学合成法生产的雎一苹果酸相当对反

2、应分离耘舍过程中延胡索酸罐化动力学进行研究，以旦2旦对l作图为一条直线，这说明t反应体系的反应速率符告米氏方程，并计算出c。一c。 c。一c，相压的动力学参数关键词苹果酸 反应分再耦夸延胡索酸尊生物反应和产物分离过程耦合可以实现高底物浓度的发酵或酶转化，消除或减轻产物对生 物催化剂的抑制，增加反应速率。同时，还可以起到降低产物分离能耗、简化产物分离过程、 降低生产成本的作用，具有十分广阔的应用前景。作为近年来兴起的这一集反应过程和产物分离 过程于一体的新颖技术理论。在研究过程中，将该技术应用于三一苹果酸生产中，取得了重大突破。富马酸钠在延胡索酸酶的作用下，转化生成苹果酸钠是典型的可逆反应，转化

3、率为7080，反 应液中苹果酸含量为10f一”，虽然采用优化的高浓度富马酸铵体系，可以提高转化率达踮90，酶转化液中苹果酸含量达2041，较普通采用的富马酸钠体系提高了一倍。随着反应分离耦合研究的不断发展，能否采甩该法生产一苹果酸?本文探讨了反应分离耦合技术在生产一苹果酸中的应用。巧妙地运用了溶解度的差别在游离延胡索酸酶的催化下，将生物反应过 程中生成的一苹果酸钙盐不断地从溶液中析出，反应不断地向着生成产物的方向移动，反应转 化率高达999，对富马酸钙的转化量达320wv)，大幅度提高目的产物在酶转化液中的 浓度，显著降低分离成本。同时，该分离耦台技术亦成功地应用于上一丙氨酸的生产中，转化率

4、达100对天门冬氨酸的转化量可达260(wv)，产品浓度提高了，生产成本明显降低。 当然在其他产品诸如对羟基苯甘氨酸，一苯丙氨敬生产过程中亦可使用该反应分离耦合技术， 提高收率、降低成本。1材料与方法11试剂 富马酸，工业级，苏州合成化工厂。 碳酸钙，工业级，泗联化工厂|_l12菌株本文所用的菌株为产氨短杆菌ma一2(brevibacterium ammoniagenesma-2)和黄色短杆菌ma一3(brevibacteriumlavum ma-3)。13培养基组成131斜面培养基上述两株菌均于普通肉汤培养基中培养，其成分为：蛋白胨1，牛肉膏0s，氯化钠05，ph为70。132产氨短杆菌ma

5、一2发酵培养基成分柠檬酸氢二铵3，kh2p04 o撕，mgs047h20o05，玉米浆45，用30naoh调节ph至75左右，灭菌后各用。133黄色短杆菌ma一3发酵培养基成分丙二酸2，kh2p04 o2，mgs047r120005玉米浆2用30naoh调节ph至75左右，灭菌后皤用。14培养条件-产氨短杆菌ma一2(丑ammoniagenes ma-2)于3234c下培养2436h，摇瓶接种量为10，摇床转速180rmin，工业化生产中按800i-发酵罐计，接种量为05l黄色短杆菌ma一3(b加vl ma一3)培养温度为3032c其余条件同产氨短杆菌ma一2。15仪器 du650分光光度计(

6、beckman)。mdl00-2电子分析天平(上海第三分析仪器厂)。jjl一型定时电动搅拌器(金纭国华仪器厂)。 hh司14一型电热恒温水浴锅，(常州国华仪器厂)。16分析方法： 富马酸含量的测定详见文献【2】。 苹果酸含量的测定详见文献【3l。2生物反应与分离耦合生产工一苹果黢过程及原理传统的一苹果酸生产工艺即审内外普遍采用贲勺固定化延胡索酸酶生产工艺是将底物富马酸 配成富马酸钠或富马酸铵j在延胡索酸酶的作用下进行水合，生成相应的苹果酸盐，反应式如 f：矗lmarasena2fu或(nil4)2凡+h20n2iia或(眦)2ma由于该反应是可逆的，通常富马酸钠盐转化体系平均转化率为7080，

7、富马酸铵盐体系转化率在88-90，产物浓度在1020，还需进行“转晶”等工艺处理方能获得合格 的产品，分离成本高，消耗大量原辅材料。基于上述原因及近年来反应分离耦合原理在乙醇、 乳酸、o一干扰素等产品中成功地运用，现利用该原理把生产所得的产品不断移走，则可使反 应不断向右移动，从根本上提高酶法生产l-苹果酸的生产效率降低分离成本，缩短流程降 低投资。亦称该反应分离耦台工艺为一步酶转化法即富马酸钙晶体直接转化成苹果酸钙晶体：fumarasecafu =ca2+fu2一_2十ca2+=cata固相 液相液相 固相式中，fu2代表富马酸根，ma2一代表苹果酸根。众所周知，富马酸钙在水中的溶解度很小，

8、40时为91210moll，但苹果酸钙在同样条件f的溶解度更小，只有67510moll，它们均与液相中的酸根离子存在平衡转化关系。在生物反应分离耦合过程中，在延胡索酸酶的作用下，富马酸钙不断溶解并在延胡索酸酶的催化下将其转化生成卜苹果酸钙并且结晶析出。3结果与讨论31酶反应温度对耦合转化率的影响 任何酶催化作用本质上是一种化学反应。化学反应均以分子运动为基础。酶催化反应以酶分子与底物分子运动和分子与酶活性有关，基团的碰撞络合解离为基础。分子动能与温度高低 直接相关。因此，温度对酶的催化反应速度有着不可分割的关系。在本文中，笔者研究考察了不同温度对产氨短杆菌ma一2(bammoniagenes

9、ma-2)、黄 色短杆菌ma一3(丑pa”um ma一3)反应分离耦合生产p苹果酸的影响。结果如图1，在所研 究的温度范围内，随着反应温度的升高，其转化庠增大，40时为最大，25及50g下均较小。这是由于在较高的温度下，延胡索酸酶失活速率增加，细胞中的延胡索酸酶蛋白发生变性而失 去催化活力，使最终转化率降低，相反，在较低反应温度下，由于延胡索酸酶活力较低，因此， 最终酶反应转化率也较低。在加时，酶转化反痘处于最佳状态。j圈i 温度对转化反应的影响图2 ph对转化反应的影响32 ph对酶反应分离耦合的影响 ：酶同所有的蛋白质一样是可籍解的。酶在承溶液环境中的解离状态和行为，均受到氢离子 的左右，

10、氢离子对酶的催化反应有明显的效应，由图2可知，当ph=7075时，该酶转化反 应的平均转化率为最大值，超过这一范围，转化率迅速下降，这说明延胡索酸酶在该反应分离耦合过程中不同氢离子浓度下曳催化活力有显著变化，只有在最佳离解状态下才能与底物结合而表现出最大酶活力。33不同酶量对分离耦合反应的蓐响 在底物富马酸钙大量存在吐，形成中间产锄的量取决于延胡索酸酶的浓度，延胡索酸酶分子愈多。则底物富马酸钙转化为产物苹果酸钙盼蕈亦相应地增加，研究中笔者取16只三角瓶分别分批加入3209富马酸钙，并在瓶中各加入产氟短杆菌ma一2、黄色短杆菌ma一3的酶发酵 液20，40，60，80，90，100，110，12

11、0ml，p碍=70，在40c下反应25h后取样分析，实验结 果表明，在一定范围内，随着两菌酶发酵液量酌增加，转化率不断上升，当两菌酶发酵液量增至一定值其转化率即为恒定值，如图3所示。在该试验体系中取酶发酵液量为100ml，此时两菌酶转化率达99 9，即相当于m延胡索酸酶发酵液能将32kg富马酸钙转化成相应的苹果酸钙。7j：n?”图3 酶液体积对转化反应的影响图4反应分离耦台进程曲线34反应分离藕合进程曲线 实验室规模，笔者考察了反应分离耦合工艺的进程曲线，在两只1l的烧杯中分别加入loom!产氨短杆菌ma一2、黄色短杆菌“a一3培养液，一次性加入底物富马酸钙，在搅拌状态下连 续取样分析苹果酸含

12、量，计算出转化效率，结果如图4所示，在开始反应的前6h左右转化效率 持续一个很低的水平，随着时间的推移反应转化率不断上升，当反应进行至24h左右。总体转 化率达999。用相同的方法进行中试，根据酶培养液批次的不同，当n酶培养液转化32t马 酸钙，且其转化效率达999，所需转化时间为2q一28h。将该反应生成的苹果酸钙进行分离， 纯化所得上一苹果酸各项指标均符美国药典标准，产品中富马酸残留量在01左右，经成本核算 达16万元t，基本与化学合成法生产的dl一苹果酸相当，是固定化细胞生产成本的60。35反应分离耦合中酶反应动力学，实验中，底物富马酸钙的起始渗度c。为91102itloll，加入酶的初

13、始浓度为ck=1班，表1产氨短杆菌ma-2时阔与富马酸钙浓度的关系h乞c,，h岛(m01，1102)c。一c； c。一c。5 7，0：5!5 2，7oh955-6，3g 鳃昭鹋钾乱盯丝一_3一 郎竹娃跖黔一拈钉们蝣钙如一 嘶盯蚰珀；2鲕一 现以间歇操作测得了不同时间下富马酸钙浓度的变化，结果如表l，表2所示，并且在表中计算了!堕互，l一。根据实验提供的教据。以旦!：丝对上一作图，结果如图5所示。c。一c； c。c。 c。一c 8c。一c；487表2黄色短杆菌ma一3时问对富马酸钙浓度的关系竺。sm札剐旷1 万c-cinc。fc；t一“1。“-_-。二=。=0258 441i39 3677057

14、761187 367707s 7 091240 36951 0642 13 003704i 5 5 071450 3704203 721661 3704一经；：!。 12；堑 !z：z由图可知以生丘!对上一作图为一象直线c。一c。 c。一c；这说明该反应体系的反应速率符备米氏方程，有：，吣f-(岛一e)如ln(c巾e)将上述方程进行整理可得：!垒!：上k一上。c。一c，c。c。k。k。由上述实验结果可计算结果如表3。图5以垫丘!对!作图-c。一c；c。c；表3动力学参数动力学参数 产氨短杆菌m一2黄色短杆菌ma一3 如rnrnoll554 817 蔓s：竺竺!垫：堑 iq：!因此，反应分离耦台

15、过程酶反应动力学可用下述微分方程来表示 dcdt=2455x102c玎554x 103+c3 dcldt=3015)10c(8t7x 103h)参考文献j takata l,kayashima k，tosa t，et a1improvement ofstability offumarase activit-：ofbflavum byimmobilizationwith k-carragedmn and polyetheneiminejfermenttechn011982，60(5)：43 12 neufeld r j，peleg y，pines o，et a1l-malic acid form

16、ation by tmmobilized saccharomyces cerevisiaeamplifed for fumaraseenzyme microb technol 1991，13 02)：991 妇83 takata l，tosa t，et alreasons for the high stability offumarase activity ofbflavumcells immobilized with kcarrageenan gel，appl biotecimol 1983，8(1)：394胡永红，欧阳平凯固定化细胞生产苹果酸新工艺及动力学研究，化学反应工程与工艺，1995

17、1l(1)：1317study on the optimal conditions and kinetics ofenzyme in simultaneous reaefon andseparation forl-malic acid productionhu yonghong，ouyang pingkai。chen wuling，cai xinghai(department ofbiotechnology&bioengineering，nanjing university ofchemicaltechnology，nanjing210009)abstract the free fumaras

18、e reaction system using the principle of the simultaneous bioreactionand the product separation processes were used for producing上一malic acidthe calcium fumaratewas used as substrate to produce calcium malate directlythis new method was more advantageousthan the traditional immobilized cells conversion sys肆m in aspects such as simiple equipment and operation，high conversion efficiency and the yield of productthe results showed that at reaction temperature 40，ph7o75，reactioab time 20,-28h