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文档简介
1、斑马鱼胚胎显微注射实验步骤:显微注射是指在显微镜下操作的微量注射技术。可将细胞的某一部分(如细胞核、细胞质或细胞器)或外源物质(如外源基因、dna片段、信使核糖核酸、蛋白质等)通过玻璃毛细管拉成的细针,注射到细胞质或细胞核内。是研究各种生物分子的作用、制作转基因动物、克隆动物等的重要技术。显微注射应用的范围非常广泛,从辅助(体外)细胞受精技术至分子和细胞基本组分的转运都需使用这一技术,比较典型的是将某些物质注射进细胞中以操作和/或监测某种特定的存活细胞中的基本机体生物化学状态。这些可以注射进细胞的物质包括有:各种细胞器、激酶、组织化学标志物(比如辣根过氧化物酶或者荧光黄)、蛋白质、代谢物质、微
2、磁头、离子、抗体、基因、分子生物学的mrna和dna等等。运用这一技术,也可以实现用于单个细胞或一组细胞的较少量(皮升至毫升)药剂或药物的精确输送(微灌注),例如药理学的药物检验。斑马鱼个体小,养殖成本低,能大规模繁殖,胚胎透明,体外发育,肉眼可见,因此斑马鱼胚胎是很好的开展显微注射的材料。1、主要试剂的配制(1)胚胎培养液的配制称取0.8g nacl、0.04g kcl、0.00358g na2hpo4、0.006g kh2po4、 0.144g cacl2、0.246g mgso47h2o、0.35g nahco3、0.06g 青霉素、0.1g 链霉素加入含有800ml 灭菌水的1l烧杯中
3、,搅拌至完全溶解,再用灭菌水定容至1l。(2)显微注射指示剂的配制称取0.1克酚红溶于5ml灭菌的蒸馏水中,配制成2的母液。先用1mm滤膜过滤后,再用0.22mm的滤膜再次过滤,然后储存在-20冰箱里备用。2、显微注射操作(1)注射针头的拉制:装上一根直径为1mm的毛细管,拧紧左右两侧的夹子,做好固定,并使其中间部位对准加热丝。设定参数为: heat-600, pull-55, velocity-80, time-10。然后按开始键,等待毛细管被拉成两个所需的微注射针头。(2)琼脂糖注射槽的制作:称取0.4g琼脂糖,溶于30ml胚胎培养液中,在微波炉中加热溶解后,先倒入约10ml琼脂糖溶液到6
4、cm的玻璃培养皿中,然后将注射槽模型轻轻放置于胶面上,再倒入约20ml。琼脂糖凝固后,取出注射槽模型,便形成一个注射槽。每次使用前和使用后都用灭菌水清洗,之后加入少量灭菌水,4保存,可反复使用。(3)显微注射用的胚胎收集:注射前天晚上挑选健康性成熟的斑马鱼按雌雄1:1 的比例放入交配缸中,中间用隔板隔开。饲养水温为28,ph值为 6.57.5,光周期为14l:10d。注射当天开灯后,实验准备就绪后将交配缸中的隔板拉开。一般情况下,雌鱼在雄鱼追逐10一20分钟后开始产卵。保证每次收集到的胚胎为一细胞期,用胚胎培养液漂洗数次后即可排布于琼脂糖注射槽中用于显微注射。每次用于显微注射的胚胎数以100枚
5、为基准。(4)注射体积的确定:打开显微注射仪的电源,打开氮气罐的阀门,调整进气量为60 psi,用微量进样针吸取1l事先混入0.050%酚红的同源或异源核酸分子加到注射针底部。在物镜测微尺上滴一滴矿物油,用显微剪刀呈45度角剪掉尖端,直径约0.05mm,固定注射气压为 30psi ,在此压力下调节注射时间为 2080msec (以 10msec为间隔)的注射剂量(一般注射针头越大越能提高注射速度,注射过程中发生堵针的概率越低,但是由于机械损伤胚胎的死亡率也越高;而注射针头小时虽然死亡率低,但是容易堵针不利于大批量注射,经过长期尝试发现30msec为最佳注射时间),用物镜测微尺测量液滴直径(d)
6、为0.1-0.2mm,根据球体积 v = d3/6,计算每次注射的体积为500pl-1000 pl。(5)显微注射:用巴斯德吸管将刚刚受精的胚胎紧密排布在琼脂糖注射槽上,防止注射过程中胚胎滑动,一般排三排约为100枚胚胎。打开体视显微镜电源,选择放大倍数为210,把焦距对准第一排第一个胚胎,先用肉眼将注射针头移到该胚胎上空约5cm处,在目镜下降下针头,把针头调入到视野的中心,轻轻放下针头,直到看清楚为止。小心落下针尖,使其进入细胞质内。轻快的踩一下显微注射仪的踏板,马上轻轻上提针头,直到离开胚胎,然后用左手移到培养皿找到下一个胚胎进行注射。注射后注射的部位会出现淡淡的红色,约10秒钟才会渐渐地散去,如果是红色马上散去,说明注射液注入在绒毛膜中,必须重新再注射。(6)培养观察:注射后的胚胎,用巴斯德吸管吸取几滴胚胎培养液滴加到注射槽内,刚好淹没所有胚胎,在室温下放置15-20分钟,让注射液在胚胎内部被充分吸收,然后用巴斯德吸管吸取一管胚胎培
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