快速老化小鼠P8肾脏衰老的病理特点

1、DOC 格式论文，方便您的复制修改删减快速老化小鼠P8肾脏衰老的病理特点（作者：单位：邮编：）作者：施晓芸 陈晓春 石艳清 杨明 叶洪 赵朝晖【摘要】 目的 观察快速老化小鼠P8（SAMP8肾脏病理结构改变。方 法 以9月龄SAMP为衰老动物模型，同龄抗快速老化小鼠R1（SAMR1） 为对照，通过PAS Masson染色及衰老相关拟半乳糖苷酶（SA拟p 拟gal）组织化学染色观察肾脏组织病理的改变，免疫组化方法比较 肾小管间质细胞外基质（ECM）成分一一纤维连接蛋白（FN）、皿型胶 原（Col皿）的变化。结果9月龄SAMP&J、鼠光镜下肾脏病理表现为 小管间质纤维化、局灶节段性肾小球硬化等，以

2、小管间质损害较为显 著;SA拟p拟gal染色阳性细胞显著增加；免疫组化结果显示FN Col 皿在肾小管间质过度沉积。上述改变与SAMR组相比，差异有显著性。 结论SAMP8肾脏的病理改变符合肾脏衰老的特点。【关键词】 快速老化小鼠；衰老；肾脏【Abstract Objective To study renal pathological structural changes in senescenee accelerated mouseP8 （SAMP8）. Methods SAMP8 （9 mon ths） were used as sen esce nee ani mal model and

3、 sen esce nee accelerated mouse/resista nee 1 (SAMR1) withsame age as a control group. Aging kidney pathologywasdeterm ined by several sen esce nt in dicators, such as PAS and Mass on stai ning. SA 拟 B 拟 galactosidase activity was measured by histochemistry staining and extracellular matrix componen

4、ts (fibro nectin andcollage n 皿)were measured byimmun ohistochemicalstai ning.Results Compared with SAMR1group, SAMP8 group appeared differe nt levels of sen esce nee.Renal pathological structural cha nges in SAMP8 (9 mon ths),includingtubulointerstitialfibrosis and focalsegmentalglomerulosclerosis,

5、 were found through microscope, and there was significant injury in the tubulointerstitial. Positive staining for SA拟 B 拟galactosidase was widely observed. Andthe expressi ons of fibr on ect inand collage n皿 in creasedremarkably which in dicat ingtubul oin terstitialfibrosis.Con clusi ons Renal path

6、ological cha nges in SAMP8 mice accordwith the pathological characteristic of aging kidney.【Key words SAM; Senescenee; Kidney快速老化小鼠(senescenee accelerated mouse , SAM是 目前人类 衰老相关疾病研究领域广泛应用的动物模型， 其特异性衰老相关的病 理表型与许多人类老年性疾病的病理改变类似，且发生率及严重程度 随年龄增长而增加，如亚系之一的 SAMP8(SAM/pro ne 8庄要表现为 学习记忆力障碍和低恐怖低紧张状态，故常应用于人类

7、老年期痴呆的研究。肾脏是机体衰老过程中变化最为显著的器官之一，有关SAMP8肾脏的病理特点却鲜见报道。本文将就SAMP肾脏的病理结构作一初 步研究。1材料与方法1.1实验动物 以9月龄SAMP为研究对象，同龄生命过程正常的SAMR1（SAM/resistanee 1）为对照，每组各8只，均为雄性，体重3040 g （购自北京大学医学部实验动物科学部），SPF环境下饲养。1.2药品和试剂X拟gal美国Sigma公司；兔抗小鼠纤维连接蛋 白（FN）多克隆抗体美国LABVISION公司；兔抗小鼠皿型胶原（Col皿） 多克隆抗体武汉博士德生物工程有限公司。1.3组织标本收集和处理 氯氨酮以70 mg/

8、kg体重的剂量腹腔注 射麻醉小鼠后，腹正中切开，原位灌洗，剥离双肾，取一侧肾脏置于 新鲜配制的4%多聚甲醛溶液中固定24 h（置于4C冰箱），用于制备 石蜡切片;另一侧肾脏分成数块，以OCT包埋，液氮冷冻后-80 C冻存， 用于制备冰冻切片，进行衰老相关B拟半乳糖苷酶（SA*B拟gal）的组织化学染色。1.4 PAS染色和肾小管-间质损伤评分PAS染色按常规方法操作， 光镜下每张切片按顺时针方向随机选取20个肾小管拟间质视野（X400倍），行小管拟.间质损伤评分：0分：肾小管间质无明显病变;0.5 分：小的局灶性的小管间质损伤;1分：皮质区小于10%的小管间质损 伤;2分：皮质区存在10%25

9、%勺小管间质损伤;3分：皮质区存在 25%75%J、管间质损伤;4分：皮质区存在75%小管间质损伤。计算每张切片平均值。1.5 Masso n染色和肾小管间质纤维化指数 Masson染色按常规方 法操作，取Masson染色组织切片，利用Imag我Pro Plus Version 6.0 医学图像分析系统，在同一条件下对每张标本选取 15个不重复视野 （X 400），将呈现为蓝色的纤维区域（去除肾小球和大血管）视作阳性 目标，以阳性面积与统计场总面积的比值作为肾小管间质纤维化指数1。1.6 SAa B拟.gal染色SA拟B拟gal染色按常规方法操作，染色 后的衰老细胞为靛蓝色，显微镜下每张切片按

10、顺时针方向随机选取20个视野（X 100），结果采用半定量评分2： 0分：无阳性染色出 现;1分：偶见小管内有微弱染色;2分：部分小管节段出现阳性染色;3 分：大部分小管出现弥漫性阳性染色。1.7免疫组化方法检测FNCol皿2卩m石蜡组织切片黏附于多 聚赖氨酸黏片剂处理后的载玻片上，经60 C烤片，常规脱蜡至水，3%氧化氢室温孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶，FN Col皿 分别以0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）高压抗原修复和微波抗 原修复，分别滴加一抗（FN 1 : 250、Col皿1 : 100）4 C孵育过夜后， 以二抗（羊抗兔）37 C孵育30 min，DAB显色

11、，苏木素染核，分化、返 蓝、脱水、透明、封片。每组染色均设以PBS弋替一抗作阴性对照。取染色后的切片，高（X 400）或低倍镜（X 100）下随机选择20个 肾小球视野或20个肾小管拟间质视野，根据染色强度和面积，按下列 方法进行半定量评分。1.8统计学处理 测定值以x 士 s表示，采用SigmaStat 3.5软件 包分析，组间比较用t检验。2结果2.1肾脏组织病理学改变SAMP8组可见弥漫的肾小管基底膜增 厚皱缩，小管上皮细胞水肿、变性、坏死，小管弥漫性囊状扩张、萎 缩，局灶性小管消失，小管内可见管型，间质增宽，大量炎性细胞浸 润，胶原纤维含量显著增加，小管间质纤维化明显，病变严重区域可

12、见肾小球肥大，系膜增生，节段性肾小球硬化；SAMR1组肾小球及小管间质结构无明显异常，偶在肾小球包曼氏囊和基底膜处有少量胶原 纤维，间质胶原纤维含量少。两组间比较有显著性差异(P0.01)，见图1,表1。2.2肾组织FN Col皿免疫组化染色2.2.1 FN在肾组织中的表达FN主要定位于肾小球系膜区和肾小 管基底膜，小管间质亦有少量表达。SAMP组肾小球内棕黄色阳性染 色呈密集条索状，着色深，肾小管基底膜和小管间质亦见较多沉积， 平均阳性积分为9.14 士 2.19;SAMR1组肾小球内可见散在阳性染色， 着色浅，肾小管基底膜阳性染色也较浅，肾间质基本无着色，平均阳 性积分为1.50 士 1.

13、20。两组相比有显著性差异(P0.01)，见图2。2.2.2 Col皿在肾组织中的表达 Col皿主要定位于肾小管间质， 表达部位与Masson染色纤维化部位基本吻合。SAMP8I肾小管间质 可见大量Col皿沉积，成条索状或小片状分布，着色深，平均阳性 积分为8.57 士 0.54;SAMR1组则偶见表达，着色浅，平均阳性积分为0.88 士 0.84。两组相比有显著性差异（P0.01），见图2。2.3 SA拟B拟.gal染色结果 两组SA以B拟gal染色阳性（靛蓝 色）的细胞均定位在肾小管，肾小球中鲜有表达。SAMP8&衰老细胞明显增加，大部分小管出现弥漫性阳性染色，SAMR组偶见小管内有微弱染

14、色，两组间比较有显著差异（P0.01），见图3,表1。图1 SAMP8 和SAMR组小鼠肾脏PAS及 Mass on染色（X 400）3讨论SAM是由日本京都大学胸部疾病研究所从 1970年起开始培育而 成。作为衰老模型，选择性育种是其唯一的干预手段3。SAM所表 现出的特异性与衰老直接相关的病理生物学表型与许多人类老年性 疾病的病理改变类似4，人类许多老年性疾病如肺泡扩张、骨质疏 松、骨关节疾病、学习记忆功能障碍、情感紊乱（抑郁）、白内障、听 觉障碍、脑萎缩、免疫缺陷等在 SAMP不同亚系上均有不同程度的体 现。而SAMRE系的各项生理指标及生存期限与其他品系正常小鼠相 似，目前大量研究均以

15、SAM系作为SAMP系的正常对照。SAM品系是 探讨衰老及衰老相关疾病的发生机制，评价药物疗效及作用机制的良 好动物模型。肾脏是机体内重要的脏器，也是容易受损伤、衰老较明显的器官。 肾小球基底膜增厚、系膜基质增生、节段性肾小球硬化、肾小管萎缩 及小管间质纤维化、动脉内膜纤维性增厚是肾脏衰老的主要组织学特 征5，其病理基础为ECM异常积聚。研究证实，肾间质纤维化程度 与肾功能减退的相关性，比肾小球硬化与肾功能减退的相关性更为密 切6肾间质纤维化以肾间质中细胞及胶原成分聚集增多，间质扩 张，伴有小管上皮细胞的丢失（因为转分化为成纤维细胞或凋亡）而导 致肾小管萎缩或扩张变形为特征。SAMP呼均生存期

16、限为1213个 月，46月龄后开始出现衰老征象，故 9月龄已进入老化阶段。本 研究结果提示，SAMP在进入快速老化阶段后，其肾脏病理改变符合 衰老肾脏的特点,9月龄SAMP&J、鼠肾脏以小管间质衰老改变较为明 显。研究表明，对SPF环境下饲养的512月龄的SAM（SPF SAM）进 行病理组织学检查，发现 SAMP/1/Ta P/3/Ta、P/8/Ta的胸腺皮质区 存在严重的淋巴结缺失，而皮质区淋巴结与髓质区淋巴结的形成有 关，同时，在下颌腺、肾脏和其他外周组织中有明显的淋巴细胞浸润。 肾上腺的形态计量学分析显示雄性 SAMP/8/Ta小鼠在5月龄时即出现 皮质区萎缩，而髓质区过度增生。病理学

17、检查发现的另一特征性改变 为雄性P/3/Ta和P/8/Ta肾脏近曲小管明显的空泡形成，以及P/3/Ta 睾丸血管变性。这些病理改变的发生机制都与肾上腺损伤有关，而普通环境下饲养的SAM所出现的显著特征之一一一广泛的淀粉样沉积 在SPF环境下饲养的SAM中并未观察到（本实验亦未观察到）。由此推 测，SPF SAMR老的加速可能源于胸腺和肾上腺功能紊乱7肾脏衰老是肾脏功能和结构改变的一个慢性进行性的过程。近年研究发现，在衰老进程中，有意义的肾小管间质组织病理的异常总是 先于肾小球硬化的出现。Ding等8人对衰老过程中ECM蛋白的分 析显示：在明显的肾小球硬化出现之前，ECM2在间质聚集，亦观察到作

18、为衰老的生物学标志之一，SA以B拟gal定位于肾小管上皮细胞 并随增龄表达增加。由此可以推测，肾小管上皮细胞容易衰老，衰老 的小管上皮细胞的积累可能启动了小管间质衰老的早期改变。本研究结果显示，SAMP8肾脏光镜下见以小管间质损害较为明显；SA拟B拟gal染色阳性细胞定位于肾小管上皮细胞，肾小球中鲜有表达；免 疫组化结果也显示ECM成分(FN、Col皿)在肾小管间质沉积较多，这 也是小管间质损伤的有力证据。如上文所述，衰老进程中，肾小管间 质病变先于肾小球硬化的出现，因 SAMP平均寿命为1213个月， 故考虑随着鼠龄增加，老化进程的发展，肾小球衰老改变可能会更显 著。【参考文献】1 Gall

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