第六节-DNA的变性、复性

1、第六节-DNA的变性、复性第六节DNA的变性、复性DNA 的变性(denaturation)DNA分子是由两条头尾倒置的脱氧多核苷 酸所组成，其中一条链的碱基与另一条的碱基 之间有氢键连接，并以A- T, G- C互补，整个DNA分子呈双螺旋结构。在加热、碱性等条 件下，链间氢键断裂，形成两条单链结构，这 种现象称为 DNA变性（denaturation ）。DNA在溶液中发生变性伴随着一系列的物 理化学性质的改变，如紫外吸收强度的增加 此种现象称增色效应（hyperchromicity） ; 溶液粘度的降低；沉降速度增加等。这些物理 常数常用来研究各种DNA结构和功能。对某一DNA来说，其紫

2、外吸收强度 （A 260）是双链DNA 单链DNA紫外吸收强度的增加与变性 （解链） 程度成正比。若将 A60的增加作为温度的函数作图，可得解链曲线（图2-18） o DNA的热变性 常称为DNA的 “融解” （melting ），解链曲 线的中点所示温度称为Tm或称为融点，Tm表示使50%DNA分子解链的温度。不同种类DNA 有不同的解链曲线，也有不同的 Tm， Tm随G+C（%T量呈线性增加（图2 - 19）。每增加1%G+C含量，Tm增加约0.4 C，这是由于 G/C碱基对之间的氢键多于 A/T对之故。溶液的离 子强度Tm有较大的影响，单价阳离子浓度每 增加10倍，Tm增加16.6 C。

3、某些化学试剂能 显著影响Tm值，例如甲酰胺能破坏氢键，使Tm大大降低。图2-18DNA变性过程和变性曲线图 2- 19 G+C含量对变性的影响DNA在变性过程中，其分子量不变，但二 级结构中的氢键破坏，在双螺旋解旋分离为两 条链的过程中，一级结构中的共价键都不破 坏。DNA变性有两个阶段，第一阶段部分解链， 已解开部分不规则卷曲；第二阶段为完全解 开，形成两条单链，此时若迅速泠却，每条链 自身卷曲，部分区域形成链内双螺旋（见图 2-20 ）。第一阶段变形可以逆转，即当温度降 低时，已解开的链又会重新盘绕，形成完整的 天然双螺旋。第二阶段DNA双链完全分开，很 难恢复到天然构型。I -图2-20

4、 DNA 热变性过程轻度变性，往往只有 A-T分开，G-C不分 开，富含A-T的区域就形成小“泡”，富含G-C 区域保持双链结构，在电镜中可以可以观察到 这种结构，从而推测DNA的结构特征（见图 2-21 ）。已变性的DNA若两条单链硷基组成不同, 嘌吟比例高低不一，分子量和分子密度也就不 同，所以可以用密度梯度离心或电泳法将变性 后形成的两条单链分离开来。图2-21电子显微镜下的 DNA分子的部分变性 二 DNA 复性(renaturation)在去除变性条件下，两条变性的碱基互补 的单链DNA可以恢复成双链结构，恢复原有的 物理化学特性和生物学活性，这种现象称为 DNA复性(renatur

5、ation),或称为退火(annealing )。影响变性与复性过程的主要因 素是温度、DNA浓度、复性时间和盐浓度、变 性剂浓度。与两条链之间碱基互补的程度当然 更有关系。复性的最适宜温度是Tm下25 C，在这温度下不易发生硷基错配和链内硷基配 对，如果，加热变性后将变性 DNA立即置于冰 中，会仍然保持变性状态。一般来说，DNA浓度愈高，复性愈快，因为在一定时间里，互补 的单链DNA发生碰撞的几率愈高。时间愈长， 发生复性愈多。高盐浓度易于复性， 有变性剂存在下，不易复性。一般来说，DNA浓度越高， 两条互补单链相遇的几率增加，复性的速率就 增加。DNA复性决定于互补单链 DNA的随机碰撞

6、， 是双分子反应，服从二级反应动力学规律, 反应速率可用下式表述 ：dC/dt=kC 2(1)C代表在t时间单链DNA的浓度，k为复 性速度常数。对(1)式进行积分：C/Co=1/(1+kC o t)当反应进行到一半时 变成(2),即在t 1/2时，11/2)(3)C/C =1/2=1/(1+kC简化成Cot % =1/k任何DNA勺复性都可以用它的速度常数ODNA来描述(单位是浓度-1时间-1)或以速度常数 的倒数即C ot1/2 (单位是浓度 时间)来表示 从方程(4)可知，控制复性反应的参数是 初始浓度(Co)和保温时间(t)的乘积，即Gt , 可读作“ Cot ”，用mol/L S表示

7、。达到半复性 时的Cot称为Cot 1/2。Ct 1/2愈大,反应就愈慢。可以用图2-22的Ct曲线表示DNA复性反 应。用已经复性的DNA部分（1-C/C o）对Ct的对数作图。图 2-22是几种基因组的 Ct曲 线，从图中可见每一种曲线的形状相同。反应进行到10%和90%寸的两点，Ct值相差100 倍。但每一种 Ct 1/2是不同的。表明复性是单 质性的，仅有一种复性速率相同的组分。如果两点的比值大于100倍，表明复性是异质性的，含有两种或两种以上复性速率不同的组 分。i xiq* 3 ki(r* xnr1MG各10*十10193Ja I t 】图2-22 DNA 复性速率与其长度成正比C

8、t 1/2值同基因组中 DNA量直接有关。随着 基因组变得更复杂，一定质量中个别 DNA顺序 的拷贝数会愈少。例如DNA勺G为12pg（ 1pg 约1X109 bp ）,若细菌基因组的大小为0.004pg(约 4X106bp)，那么 12pg 的 DNA中细 菌基因组每一种顺序有3000拷贝(12pg/0.004pg=3000 ),若大小为 3pg (约 3X109bp)真核基因组，那么12pg的DNA中,真核基因组的每一种顺序仅有4个拷贝。因此同样浓度的DNA在真核基因组中每一种顺序 的频率比细菌要低 5楷。因为复性反应的速率 取决于互补顺序的频率， 如果真核基因组中的 一种顺序频率要达到同

9、细菌基因组的一种顺 序相同，那麽真核基因的 DNA浓度就要比细菌 大750倍，或者，相同量的DNA耍达到相同的 复性程度，反应时间就要延长750倍。因此，真核细胞DNA复性反应的C0t 1/2是细菌的750 倍。在不存在重复序列的情况下， DNA的Gt 1/2 值与基因组大小呈正比。 因此Gt 1/2值可以用 来表示反应体系中存在的不同序列DNA的总长度。把这个总长度称为复杂性(Complexity )，通常是以硷基对数来表示复 杂性。任何基因组或它的一部分DNA的复性反应都有一个同它的复杂性成比例的Cct 1/2。因此任何DNA的复杂性就可以用它的Gt 1/2值同已知其复杂性的标准DNA的C

10、0t 1/2相比较来测定。人们通常用大肠杆菌 DNA当作标准。大肠 杆菌DNA的复杂性就是用它的整个基因组的 长度作标准（把大肠杆茵DNA看作都是单拷贝 的），即4.2X10 6bp，可以得出下式:Coti/2 （任何基因组DNA）任何基因组DNA的复杂性Cot 1/2 （大肠杆菌DNA）4.2X10 6bp4.2X106bp XCot 1/2 （任何基因组 DNA所以 任何基因组DNA的复杂性Cot 1/2 （大肠杆菌DNA真核基因组合有几种顺序组分：当真核 基因组DNA用复性动力学进行鉴定时，发现其 复性反应的Co t值的范围常跨越 8个数量 级，即从10-4至104，这个数值比方程（2）

11、所 预计的100倍要大许多（见图 2-23 ），表明真核基因组DNA的复性反应是异质性的，即其中 含有复性速率彼此不同的两个或两个以上的 组分。出现这种差异的原因是方程（2）应用于单个动力学纯的组分，相差100倍，但一个基因组实际上包含有几个动力学组分， 那么每 一种组分都有它自己所特有的复性动力学， 那 么它们的差值就远远大于100倍。图2-23表示的是真核基因组 DNA复性的Cot曲线，其 Cot值从10_ 4到104。复性反应分成三个不 同的阶段，第一阶段与第二阶段之间有一个平 坦的区域，第二阶段与第三阶段之间有轻微的 重叠，每一阶段都代表了基因组不同的动力学 组分。第一阶段的组分叫快复

12、性组分，占总 DNA的 25%, Co - t 值在 10-4 至 10-2 之间，为 0.0013。复性动力学第二阶段的组分叫中速复性组分，占总DNA的30% Cot值在 0.2100之间，Cot 1/2为1.9。第三阶段的组分叫慢复性组分， 占总DNA 的 45%, Cot 范围在 10010000 之间，Cot 1/2 为630。为了计算这些组分的复杂性，每一种 都得以独立的动力学组分来处理，即单独与标 准DNA进行比较慢复性组分占总DNA的45%那么它的Cc 就是 0.45，其 Cot 1/2 就是 0.45 X 630=283。 假定在相同条件下，大肠杆菌DNA的复性反应 的Cot

13、1/2是4,复杂性是 4.2 X 106bp，将各 项值代入（5）式，那么4.2X 106bpX 283慢复性 DNA 的 复杂性=3X 108bp用相同的方式处理其余两个组分4. 2 X 106bp X1.9X0.3中速复性的 DNA 复杂性 =6X 105 bp44. 2x106bpX0.0013X0.25快速复性的 DNA复杂性 = =340 bp4从上面结果可见，一个组分复性愈快， 其复杂性就愈小。从非重复顺序 DNA的复杂性可以估计出基 因组大小。慢复性组分的复杂性相对应于它物理上的 大小。假定图2-22中的基因组用化学方法测 出其单倍体 DNA含量为7X 10 8bp，那么它的 4

14、5%就是3. 15X 10 8bp，这同比用动力学方法 测得的数值稍大了一点(3 X 10 8bp)，但可以 看作是相同的。因此，可以说慢复性组分的复 杂性无论是用化学方法，还是用动力学方法测 定，得到的结果都是相同的。用化学方法恻得 的数值叫化学复杂性，用动力学方法测得的数 值叫动力学复杂性。这两个数值的一致性意味 着慢复性组分含有的 DNA顺序在基因组中都是唯一的，即是非重复顺序。在变性以后，每一个单链仅能同它相互补的单链进行复性，在原核细胞中几乎都是唯一的，而在真核细胞中 通常不是唯一的，只是占大多数，这部分DNA叫非重复顺序DNA我们能用非重复顺序DNA的复杂性估计出基因组的大小。例如

15、非重复顺序 DNA的复杂性 为3 X IO8bp，这部分 DNA占总DNA量的45%8 8那么，3.0 X I0 bp X 0.45=6.6 X 10 bp，这就是 基因组的大小。这就提供了另一个独立的方法 来估计基因组的大小。这同化学方法测定的结 果(7.0 X I0 8bp)是非常接近的。用动力学测定的复杂性对用化学方法测定的单倍体DNA含量作图，结果非常一致，表 明非重复顺序 DNA组分都是由在基因组中仅 有一个拷贝的DRA顺序组成。在基因组中存在多于一个拷贝的顺序叫 重复顺序，仅有一个拷贝的叫非重复顺序。正常情况下，重复频率由下式决定化学复杂重复频率 （f ）动力学复杂性重复顺序DNA包括所有重复频率显著大 于1的组分。例如某一基因组是由单拷贝的Abp长、A+ B+ C其重复频 AbP是非重复顺序，10个拷贝的Bbp长和100个拷贝的Cbp长三 部分组成，其复杂性就是 率分别为1、10和100Bbp和Cbp是重复顺序。重复频率1与2之间 也属于非重复顺序。从前面提到的例子来看， 化学复杂性是 3.15 X 10 8bp，动力学复杂性是8 83.0 X 10 bp ,仁3 . 15 X 10 bp /3 . 0 X 10 bp=1.05,所