五氯酚降解菌的驯化、筛选及其降解性能的研究

1、分类号 学号 m200873836 学校代码 10487 密级 硕士学位论文五氯酚降解菌的驯化、筛选及其降解性能的研究学位申请人： 郭 莉 明学科专业： 环 境 卫 生指导教师： 王 琳 副教授 答辩日期：2011年1月a dissertation submitted in partial fulfillment of the requirementsfor the degree of master of engineeringacclimating, screening and degradation characteristics of pentachlorophenol-degradin

2、g bacterium candidate :guo liming major :occupation andevironmental health supervisor :vice prof. wang lintongji medical college huazhong university of science & technologywuhan, hubei, 430030, p. r. china january, 2011 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发

3、表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于保密， 在 年解密后适用本授权书。不保密。（请在以上方框内打“”）学位论文作者签名： 指导教师签名：日期： 年 月 日 日期： 年 月

4、 日目 录缩略词1中文摘要2英文摘要3前 言5总实验流程图7第一部分 pcp高效降解菌的驯化、筛选及鉴定81材料与方法82结果与分析183 结论25第二部分 pcp高效降解菌a的降解特性研究261材料与方法262结果与分析293 结论33第三部分 pcp降解相关基因的克隆341.材料与方法342.结果与分析383. 结论42参考文献43附录 在校期间发表论文48致 谢49缩略词（abbreviation）英文缩写英文全称中文全称dntpdeoxy-ribonucleoside triphosphate脱氧核糖核苷三磷酸ebethidium bromide溴化乙锭eedsenvironmenta

5、l endocrine disruptors环境内分泌干扰物edtaethylene diamine tetraacetic acid乙二胺四乙酸hplchigh performance of liquid chromatography高效液相色谱msmmineral salt medium无机盐培养基odoptical density光密度值pcppentachlorophenol五氯酚pcrpolymerase chain reaction聚合酶链反应popspersistent organic pollutants 持久性有机污染物sdssodium dodecylsulphate十二烷

6、基磺酸钠tristrihydroxymethyl aminomethane三羟甲基氨基甲烷五氯酚降解菌的驯化、筛选及其降解性能的研究硕士研究生：郭莉明指导老师：王 琳 副教授中文摘要五氯酚（pentachlorophenol，pcp）曾作为木材防腐剂、除草剂、杀菌剂、杀虫剂等在工农业生产中被广泛应用。因其化学性质稳定、在环境中难以降解，严重威胁自然环境和人类健康。目前国际癌症研究总局（iarc）已经将其归为“可能的致癌物”。现有的pcp污染处理方式有物理技术、化学技术与生物处理技术。其中，生物处理技术因其具有投入低、治理效果好以及无二次污染等优点，已逐步被应用到pcp污染的治理工作中。本研究采

7、用活性污泥曝气与密度梯度驯化方法，以五氯酚为唯一碳源，定时定量逐步提高pcp浓度，经过8周驯化分离得到3株五氯酚降解菌，分别降解含有等量pcp的无机盐溶液，采用高效液相色谱法对它们的降解能力进行检测，其中菌株a降解能力较强，48h的降解率为98.6%。对菌株a进行生理生化及16s rdna序列分析，该菌株初步鉴定为施式假单胞菌。菌株a的最适生长温度为30，ph为7.0，该菌在浓度为3%nacl的普通培养基中生长良好，属于耐盐菌。通过测定不同pcp含量、接种量、温度及ph条件下菌株a对pcp的降解效率，确定最适降解条件。结果表明，高效降解菌a降解pcp的最适条件是：五氯酚初浓度为0.20.4 g

8、/l，接种量为23ml（108cfu/ml），温度为30、ph为 6.0。 使用碱裂解法对菌株a进行质粒提取，琼脂糖凝胶电泳结果显示菌株a包含一大小约700bp的质粒。sds变温质粒消除实验表明质粒消除后的菌株a对pcp的耐受力明显下降，降解率也降低至13.7%。以e.coli 为受体菌做质粒转化试验，对质粒转化成功的e.coli 进行pcp降解试验，检测得到其降解率为84.3%，降解活性略低于菌株a。关键词： 五氯酚 生物降解 降解菌 高效液相色谱 降解质粒acclimating, screening and degradation characteristics of pentachlor

9、ophenol-degrading bacteriummaster candidate: guo limingsupervisor: wang linabstractpentachlorophenol (pcp) has been used extensively as wood preservative, herbicide, fungicide, pesticides in agricultural and industrial production. it threatens seriously threatened human health and natural environmen

10、t due to its physicochemical characteristics. international agency for research on cancer (iarc) has listed pcp as a potential carcinogen. at present, physical, chemical and biological treatment methods have been applied in dealing with pcp. because biological treatment technology has lower costs an

11、d less pollution, it has aroused general concern to management of pcp. activated sludge aeration and method of density gradient were used to acclimate the sludge. using pentachlorophenol as a sole carbon source, it was increased step by step in continuous eight weeks. three pcp degrading bacterial s

12、trains were isolated from the activated sludge. then, using three strains respectively degraded pcp inorganic salt solution. high performance liquid chromatography (hplc) analysis revealed that all of them can degrade pcp. one of them (strain a) is best for it can degrade 200mg/l pcp in 48h with the

13、 degradation rate of 98.6%. the optimum growth temperature for the stain a was 30, ph was 6.0, and it was halotolerant bacteria. according to the morphological, physiological and biochemical characteristics and 16s rdna sequence, it was identified as pseudomonas stutzeri. the optimum degrading condi

14、tions were obtained by detecting the degradation effect of pcp under different conditions of bacteria inoculation amount, the inital concentration temperature, and ph. it was observed that the optimum inoculation amount of strain a for degrading pcp was 23ml（108cfu/ml）, the concentration of pcp was

15、0.20.4g/l, the temperature was 30, ph was 6.0. the plasmid of strain a was extracted by alkali splitting technique. the result showed that strain a has a plasmid about 700bp by the method of agarose electrophoresis. after the plasmid elimination experiment, we found that the toleration for strain a

16、to pcp was decreased significantly, and the degradation efficiency was decreased to 13.7%. the plasmid transformation experiment used e.coli as receptor bacterium. transformant can use pcp as its sole carbon source. the test of degrading pcp by transformant indicated that the degradation rate was 84

17、.3%, was lower than strain a. the result showed that this plasmid might play an important role in the degradation of pcp. keywords: pentachlorophenol biodegradation degradation bacterium hplc degradation plasmid前 言自20世纪30年代开始，五氯酚（pentachlorophenol，pcp）作为防腐剂被首次使用之后，因pcp及其钠盐具有高效、广谱、廉价的特点在全世界的工农业生产中得到广

18、泛使用。1997年我国pcp总产量约为1.0104吨/年，占全世界总产量的20%1。由于pcp化学性质稳定，在环境中不易降解，通常能长时间以原型或中间代谢产物存在于环境中，对自然环境和人类健康造成了严重危害。尽管pcp见光易分解，但是绝大部分pcp还是存在于土壤、水体及城市固体废弃物中。调查发现土壤、地表水、地下水及河流底泥中均可检测到pcp的存在。瑞典部分地区的土壤中五氯酚含量约0.14500mg/kg2；太湖湖水中pcp含量约为1.210-2g/l；金坛地区土壤中约为1.3g/kg；洞庭湖部分断面底泥中pcp含量高达48.3g/g（干污泥）3。有研究者对pcp废水污染严重地区土壤中的蚯蚓体

19、内pcp检测发现，蚯蚓体内pcp含量可达11.2262ng/l4。由于pcp及其钠盐的大量使用，除污染土壤、水源及动植物外，也可通过生物富集作用进入食物链，从而进入人体。1994年有报道显示加拿大saskatchewan地区，非职业暴露人群的尿中所含pcp浓度平均达1.6g/l，最低含量也超过0.2g/l5。临床流行病学调查也表明，在长期接触pcp的人群中，胎儿流产、死胎、先天性白内障、无脑畸形和生殖器异常的发生率显著高于正常人群。研究还发现pcp是一种环境内分泌干扰物6，影响人体的内分泌系统，引起甲状腺激素、性激素、肾上腺激素水平降低。目前，许多发达国家已经禁止生产和使用pcp，并将其列为优

20、先检测控制污染物7。研究显示pcp在鼠、猴和人体内的半衰期分别是15h、78h、3050h8。土壤中的半衰期约80天左右，对环境和人类健康造成很大的威胁。pcp从环境中去除的方法主要有物理法、化学法和生物法。使用物理与化学方法处理含有pcp的废水，虽然具有处理量大、快速的特点，但存在有害污染物处理不彻底、需大量使用有机溶剂等缺点，而且化学处理法不仅没有将pcp彻底降解反而转化成其它形式的氯酚再次污染环境。生物降解是指有机污染物在微生物的代谢作用下被分解的现象。因为微生物是自然环境的组成部分，所以利用生物降解法去除环境中的有害物质，不仅降解效果好、成本低，而且不会造成二次污染。目前，研究已经发现

21、多种微生物可对pcp进行有效的降解，如外生菌根真菌9、黄孢原毛平革菌10、木霉菌属、毛霉菌属、青霉菌11、芽孢杆菌属12、假单胞菌属13、不动杆菌属14、假平胞菌属15等。通常对这些微生物的鉴定是用生理生化与分子生物学鉴定相结合的方法，其中分子生物学鉴定中的16s rdna 是最常用的方法16，因为16s rdna基因序列包含10个可变区和11个恒定区17，可变区与细菌的系统发育密切相关，而且16s rdna具有分子量大小适中，突变率小等优点。wose 与olsen18基于16s rdna的分析构建了已被公认的全生命系统进化树。在微生物降解的试验中，研究者也发现许多微生物对环境污染物的降解与其

22、体内所含的质粒有关，通常将这种与降解有机污染物有关的质粒称为降解性质粒。如甲苯、二甲苯及多氯联苯等在生物降解过程中都与微生物的质粒相关。刘春19等人也从降解硝基苯的假单胞菌xn-1中提取得到降解性质粒；吴海珍20等使用活性污泥驯化法，分离得到一株能够降解邻氯硝基苯的降解菌，并从该菌株体内提取出降解性质粒。thakur21人的研究报道，pseudomonas sp. 130含有降解pcp的质粒，并将其成功转载于e. coli jm109中。同时研究者在生物降解pcp的实验中也发现，过氧化物酶22、酚氧化酶23、辣根过氧化物酶24及漆酶9等在降解pcp的过程中有重要作用。本研究从活性污泥中驯化得到

23、3株pcp降解菌，通过对pcp降解效果的比较，筛选出一株高效降解菌，并对这株高效降解菌降解pcp的适宜条件以及降解质粒进行一系列的实验室研究，为生物修复环境中的pcp提供一定的科学依据。 本课题为国家自然科学基金资助项目（no. 30771776）的部分研究内容。总实验流程图形态、生理生化及16s rdna鉴定采集活性污泥（武汉市某啤酒厂废水处理站二沉池）密度梯度梯度法驯化pcp高效降解菌筛选、分离、纯化pcp高效降解菌高效降解菌鉴定降解特性研究降解条件研究（pcp含量、接种量、ph及温度）降解质粒研究质粒检测质粒消除质粒转化降解动力学模型及动力学方程分析第一部分 pcp高效降解菌的驯化、筛选

24、及鉴定pcp作为农药和木材防腐剂曾在世界范围内被广泛使用，因其对生物体的广谱毒性与诱变性己被确认为环境中主要的pops之一25。pcp宜光解，不易被氧化，也难溶于水，但能强烈地吸附在土壤中，特别是酸性土壤，污染环境，进而被植物吸收，进入食物链，危害人类健康。自然环境中存在多种能够降解有机污染物的土著微生物，如赵光辉26等研究发现的土著嗜油菌；常文越27等利用土著微生物修复铬污染的土壤，但土著微生物对有害物质的去除能力较低，并不能满足治理环境污染的需要。目前的研究发现，使用活性污泥驯化培养的微生物，对环境有害物质有良好的降解效果28。本部分研究采用活性污泥与密度梯度驯化法，驯化、筛选、分离、纯化

25、pcp高效降解菌，并对其进行形态特征、生理生化以及16s rdna的鉴定，确定高效降解菌及其所属种属，为进一步探讨高效降解菌降解pcp的特性奠定基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 主要试剂主要试剂见表1-1。1.1.2 主要仪器主要使用仪器见表1-2。1.1.3 主要试剂的配置29, 30 1.1.3.1 驯化用无机盐培养基：称取nacl 1g、nh4no3 0.5g、fecl3 0.01g、k2hpo43h2o 1g、mgso47h2o 0.4g、cacl22h2o 0.1g，溶于900ml蒸馏水中，用naoh调节ph值至7.2，定容至1l。1.1.3.2 降解试验用无机盐培养基（m

26、sm）：称取nacl 1g、k2hpo43h2o 1g、mgso47h2o 0.4g、nh4cl 0.5g，溶于900ml超纯水中，用naoh调节ph值至7.2，定容至1l，121高压蒸汽灭菌20min，4冷藏备用。表1-1 实验试剂列表table 1-1 the list of chemicals in the experiment名称name纯度purity出厂单位manufactory氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾分析纯国药集团化学试剂有限公司二氯甲烷、甲醇色谱纯天津科密欧化学试剂开发中心pcp分析纯成都爱斯特医药技术有限公司乙酸铵分析纯天津市风船化学试剂有限公司牛肉膏分析纯武汉天益生化有限

27、公司蛋白胨分析纯北京奥博星生物技术有限公司酵母提取物、胰蛋白胨分析纯英国oxoid公司sds、eb分析纯美国sigma 公司dntp 、taq聚合酶高纯度美国fermentas公司琼脂糖高纯度英国oxoid公司超纯水18.2m德国sg超纯水器表1-2 试验常用仪器列表table 1-2 the list of common instrument名称name型号model出厂单位manufactory恒温摇床thz-100上海一恒科技仪器厂生物安全柜hfsafe-760s中国healforce公司pcr仪2720德国biometra公司ccd凝胶成像系统g-box法国vilber lourmat

28、公司紫外分光光度计722上海第三分析仪器厂超声波细胞粉碎机jy96-n宁波新芝生物科技股份有限公司高速低温离心机32r-1610德国hettich公司显微镜ix-sp日本olympus公司高效液相色谱仪waters-717-1525-2487美国waters公司1.1.3.3 磷酸盐缓冲液（pbs）的配置称取137mmol/l nacl、2.7mmol/l kcl、10mmol/l na2hpo412h2o与2 mmol/l kh2po4于烧杯中，加900ml超纯水，用磁力搅拌器搅拌使其充分溶解，调节ph值为7.4，定容至1l分装后121高压蒸汽灭菌20min， 4保存备用。1.1.3.4 p

29、cp实验水样取50ml msm培养液，加入至250ml玻璃锥形瓶中，高压灭菌。加入实验所需含量的pcp后充分振荡后备用。1.1.3.5 普通肉汤培养基分别称取牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，溶于900ml超纯水中，用naoh调节ph值至7.2，定容至1l，121高压蒸汽灭菌20min，4冷藏备用。1.1.3.6 lb（luria-bertani）培养基： 胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，溶于900ml蒸馏水，用naoh调节ph值至7.0，定容至1l，121高压蒸汽灭菌20min，4冷藏备用。1.1.3.7 普通琼脂平板培养基 分别称取牛肉膏 3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，

30、琼脂1525g。除琼脂外，其余成分溶于900ml蒸馏水中，用naoh调节ph值至7.27.4之间，定容至1l，加入琼脂1525g，121高压蒸汽灭菌20min，待冷却至50左右，倾倒培养基于培养皿中，每个培养皿约20ml，制成平板备用。1.1.3.8 lb（luria-bertani）琼脂平板培养基 胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，溶于900ml蒸馏水，用naoh调节ph值至7.0，定容至1l，加入琼脂后于121高压蒸汽灭菌20min，待冷却至50左右，倾倒培养基于培养皿中，每个培养皿约20ml，制成平板备用。1.1.3.9 10tbe配置： 称取121g tris碱、51.35

31、g硼酸、3.72g edta，充分溶解于1000ml超纯水中，4冷藏备用。1.1.3.10 溴化乙锭（eb）储备液（10mg/ml）在10ml去离子水中加入100mg eb，磁力搅拌数小时，以确保其完全溶解，室温避光保存，临用时将储备液稀释，使其终浓度为20g/l。1.1.3.11 革兰氏染液（1）草酸铵结晶紫染液：a液：结晶紫2g，95%酒精20ml。b液：草酸铵0.8g，蒸馏水80ml。 将结晶紫研细后，加入95%酒精，使之溶解，配成a液；将草酸铵溶于蒸馏水，配成b液。将a液与b液两液混合即成为草酸铵结晶紫溶液，4冷藏备用。 （2）沙黄：2.5%的番红o液（用95%酒精配置成）10ml，蒸

32、馏水90ml，4冷藏备用。（3）路哥式（lugol）碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于35ml蒸馏水中，然后加碘摇匀，使碘完全溶解后，再加蒸馏水至足量，装入棕色试剂瓶，4冷藏备用。1.1.3.12 盐酸四甲基对苯二胺溶液：称取1g盐酸四甲基对苯二胺溶于50ml蒸馏水中，定容至100ml后，盛放于棕色瓶中4冷藏备用。1.1.3.13 硝酸盐培养基硝酸钾0.2g，蛋白胨5.0g，溶于900ml蒸馏水中，用naoh调节ph值至7.4，定容至1l，121高压蒸汽灭菌15min，4冷藏备用。1.1.3.14 吲哚培养基胰蛋白胨20g，氯化钠5.0g，溶于900ml蒸馏水中，用na

33、oh调节ph值至7.4，定容至1l，121高压蒸汽灭菌15min，4冷藏备用。1.1.3.15 赖氨酸脱羧酶培养基：酵母浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖1.0g，l-赖氨酸5.0g，溴甲酚紫0.06g，溶于900ml蒸馏水中，用naoh调节ph值至6.8，定容至1l，115高压蒸汽灭菌30min，4冷藏备用。1.1.3.16 营养明胶蛋白胨5.0g，牛肉膏3.0g，明胶120g，溶于900ml蒸馏水中，用naoh调节ph值至6.87.0，定容至1l，分装小管，121高压蒸汽灭菌10min后，取出迅速冷却使其凝固备用。1.1.3.17 尿素酶琼脂蛋白胨1.0g，氯化钠5.0g，磷酸二氢钾2.

34、0g，葡萄糖1.0g，尿素20.0g，酚红0.012g，琼脂15.0g，蒸馏水900ml。除酚红与尿素外，将各成分加热溶于900ml水中，调ph至7.0，加入酚红试剂摇匀，于121高压蒸汽灭菌15min，冷却约55后，加入已过滤除菌的20%尿素水溶液100ml，混匀以无菌操作分装无菌试管，每管34ml制成斜面备用。1.1.3.18 葡萄糖发酵管牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钠2g，0.2%溴麝香草酚蓝溶液12ml，溶于900ml蒸馏水中，用naoh调节ph值至7.4，定容至1l，按0.5%加入葡萄糖，于121高压蒸汽灭菌15min，4冷藏备用。1.1.3.19 甲基红（mr），

35、乙酰甲基甲醇试验（vp试验）试验多价蛋白胨7.0，磷酸氢二钾5.0，葡萄糖5.0，溶于900ml蒸馏水中，用naoh调节ph值至7.0，定容至1l，121高压蒸汽灭菌15min，4冷藏备用。1.1.3.20 半固体培养基 牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，琼脂35g，溶于用900ml蒸馏水中，用naoh调节ph值至7.27.4，定容至1l，分装小管于121高压蒸汽灭菌15min，取出直立试管待凝固。1.2 方法1.2.1 驯化pcp降解菌化合物生物降解的驯化期是指微生物从开始接触有机化合物到该有机化合物被明显分解的这段时间31。驯化期的长短与微生物遗传性、菌龄以及微生物与有机化合物接触前后的环

36、境条件等因素有关，同时也与有机物的性质和浓度有关。驯化期是有机物生物降解难易程度的一种反映，通常在几小时到几天，也可能延长至几个星期。1.2.1.1 采集活性污泥 本实验活性污泥采自武汉市某啤酒厂废水处理站二沉池。1.2.1.2 驯化pcp降解菌 取活性污泥6.5l于曝气池中，并向曝气池中加入19.5l驯化用无机盐培养液，持续曝气。从第1周开始定时投加pcp，其投加量每周按10、20、30、40、60、80、100、140mg/l依次递增，共驯化8周。在驯化期间定期补充无机盐培养液，以保持活性污泥与驯化用无机盐培养液体积之比为13，曝气池温度为2530，ph为7.0。1.2.2 pcp降解菌的

37、分离纯化 用50ml灭菌采样管从曝气池中留取活性污泥样品，按上、中、下三层，每层取1ml，并对这三支样品按10-1、10-3、10-5、10-7进行梯度稀释，稀释之后分别取样15l进行普通营养琼脂平板涂布，待37恒温温箱内培养24h、长出肉眼可见的菌落后，挑取不同形态的菌落反复平板划线培养，以获得纯种pcp降解菌。 1.2.3 pcp高效降解菌的筛选分别取纯化细菌一环接种于20ml lb培养基内，置于恒温摇床（温度37、摇床转速120r/min）培养12h。将培养液倒入50ml灭菌离心管中，5000rpm离心5min，弃上清。向其中加入灭菌pbs缓冲液并震荡混匀制成试验用菌悬液（108个/ml

38、）。取等量的菌悬液2ml，分别加入50ml 含pcp浓度为0.2g/l的无机盐培养液中，在37、转速为120r/min的恒温摇床内连续降解48h。空白对照为不加降解菌含0.2g/l pcp的50ml无机盐培养液。1.2.4 pcp分析方法 水样处理：水样用30ml二氯甲烷分三次萃取降解液，合并萃取液。每次萃取时震荡2min，静置15min，收集有机相。氮气挥干后加入1ml二氯甲烷定容。采用高效液相色谱（hplc）测定，pcp分析条件：agilent tc-c18柱（4.6150mm, 5m）；流动相：甲醇乙酸铵(2g/l)=7030；流量：1.0ml/min；柱温：25；紫外检测波长：219n

39、m；进样量：10l。标准曲线绘制：以甲醇为溶剂，准确称量pcp配置浓度为0.024、0.036、0.12、0.24、0.36、0.6、0.8g/l的标准溶液。根据标准溶液的浓度和色谱峰面积绘制标准曲线。1.2.5 pcp降解率的计算r =a0a100%a0式中r：pcp降解率（%）；a0：pcp的初始投加量（mg/l）；a：降解后pcp的残余量（mg/l）。1.3 菌株鉴定细菌分类鉴定32方法分为表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类，分为4个不同水平：细胞形态和习性水平、细胞组分水平、蛋白质水平与核酸水平。表型鉴定法有常规鉴定法、数值分类鉴定法和化学分类鉴定法。分子遗传学鉴定法是核酸水平的鉴定，

40、对细菌染色体和质粒dna进行分析，包括g+cmo1%含量测定、核酸杂交、pcr技术、16srrna和1623srrna序列分析、全基因组测序等。1.3.1 革兰氏染色 采用初染、媒染、脱色、复染四部染色法。（1） 涂片：取干净玻片一块并做好标记，用接种环取一环新鲜菌液，缓慢涂于玻片中央，形成直径1cm涂层，将玻片反复在酒精灯火焰上方快速加热，对标本进行干燥、固定。（2） 初染：加草酸铵结晶紫一滴，约1min，水洗。（3） 媒染：滴加碘液冲去残余水，并覆盖约1min，水洗。（4） 脱色：将载玻片上面的水甩干净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约2030sec，立即用

41、水冲净酒精。（5） 复染：用番红溶液12min，水洗，室温下晾干后在显微镜下观察。1.3.2 生化鉴定参考常见细菌鉴定手册33和bergeys manual of determinative bacteriology34。本实验从氧化酶试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、氨基脱羧试验、明胶液化试验、尿素酶试验、葡萄糖试验、动力学实验、甲基红试验及乙酰甲基甲醇试验（vp试验）十个方面对菌株进行生理特征鉴定。1.3.2.1 氧化酶试验取滤纸蘸取待测菌落，加盐酸二甲基对苯二胺1滴，观察颜色变化，阳性者立即呈现粉红色或红色，颜色逐渐变深至深紫色。1.3.2.2 硝酸盐还原试验将待测菌株接种至硝酸盐液体培养

42、基中，35恒温温箱培养1824h，加入0.1ml对氨基苯磺酸与-萘胺醋酸混合液于试管中，观察结果，出现红色为阳性，无颜色变化为阴性。1.3.2.3 吲哚试验将待测菌株接种至蛋白胨水培养基中，35恒温温箱培养1824h，盐管壁徐徐加入欧式试剂0.5ml，分为两层，两层液体交界出现红色为阳性，无色为阴性。1.3.2.4 氨基脱羧试验将待测菌株接种于氨基酸培养基及对照培养基中，35恒温温箱培养14d，培养基由黄色变为紫色为阳性，黄色为阴性，对照培养基为黄色。1.3.2.5 明胶液化试验将待测菌株穿刺接种于明胶培养基，20恒温培养57d，观察到半固体培养基不在凝固为阳性。1.3.2.6 尿素酶试验将待

43、测菌株接种于尿素培养基中，35恒温温箱培养1824h，观察结果，培养基变红为阳性，不变为阴性，阴性应继续观察4d。1.3.2.7 葡萄糖发酵试验将待测菌株接种至糖发酵培养基中，35恒温温箱培养24h后观察结果，接种的细菌若分解培养基中的糖类产酸，将使培养基中的指示剂显酸性反应，培养基颜色发生变化；若产气可使液体培养基中的导管内出现气泡，培养基无变化则表示细菌不分解其中的糖类。1.3.2.8 动力试验挑取待测菌株穿刺接种至半固体培养基中，37恒温温箱培养12h后观察结果，如果沿着穿刺线边缘有扩散，说明待测菌株有鞭毛，动力试验呈阳性；无扩散者为动力学试验阴性。1.3.2.9 甲基红试验将待测菌株接

44、种植葡萄糖蛋白胨水培养基中，35恒温温箱培养23d后，每2ml培养液中加0.04%甲基红酒精溶液23滴观察结果，红色为阳性，橘红色为弱阳性，黄色为阴性。1.3.2.10 乙酰甲基甲醇试验（vp试验）将待测菌株接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，35恒温温箱培养48h后，每2.5ml培养液中加入5% -萘酚0.6ml，再加入koh溶液0.2ml震荡观察结果，红色为阳性，不出现红色为阴性。1.3.3 16s rdna鉴定13.3.1 降解菌株总dna的提取使用天根细菌总dna提取试剂盒，步骤如下：（1）取细菌培养液15ml，104rpm离心1分钟，尽量吸净上清。（2）向菌体沉淀中加入500l灭菌超纯水，

45、震荡至菌体彻底悬浮。（3）使用超声波细胞粉碎机破碎菌体，20hz，2min，注意要将eppendorf置于冰河上，防止产热温度过高，破坏细胞。（4）104rpm离心3min，取上清于一新eppendorf管中。（5）向管中加入20l蛋白酶k溶液，混匀。（6）加入220l缓冲液gb，将eppendorf管颠倒数次，70放置10min，溶液变清亮，离心机快速离心5sec，以集中样品。（7）加220l无水乙醇，充分震荡混匀15sec，离心机快速离心5sec，以集中样品。（8）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中，12,000rpm离心30sec，倒掉废液。（9）向吸附柱中加入500l缓

46、冲液gd，12,000rpm离心30 sec，倒掉废液。（10）向吸附柱中加入700l漂洗液pw，12,000rpm离心30 sec，倒掉废液。（11）向吸附柱中加入500l漂洗液pw，12,000rpm离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。（12）将吸附柱转入一个干净的eppendorf管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50lte，室温放置25分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到eppendorf中，即可立即使用或20保存。1.3.3.2 降解菌株16s rdna的pcr扩增通常使用试剂盒提取的dna分子浓度较低，所以常用聚合酶链式反应

47、（pcr）技术对目的片段扩增。本研究采用pcr技术，对pcp高效降解菌株的16s rdna进行扩增。（1）pcr扩增的模板：1.3.3.1中提取出的菌体dna为pcr扩增模板。（2）pcr反应引物采用的是细菌16s rdna的通用引物35：正向引物：5gattagataccctggtagtccac3；反向引物：5cccgggaacgtattcaccg3。上述引物是由上海生工生物技术服务有限公司合成。（3）pcr反应体系： pcr反应体系体积为50l，反应体系如下：dna模板2l正向与反向引物3ldntp1l10pcr缓冲液5lmg24ltaq酶0.3lddw补至50l按上述组分配好反应液，分装

48、于200l eppendof 管中，离心机快速离心5sec后，进行pcr扩增。（4）pcr反应条件：pcr反应条件如下：步骤温度时间循环次数预变性94.55min1变性941min30退火551min延伸722min终末延伸7210min1保温4设阴性对照，以超纯水代替模板，其它反应参数相同。pcr反应结束后，吸取5l pcr产物与1l loading dye 混合，以0.5tbe为电泳缓冲液，1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，80v恒压电泳60min，凝胶成像仪观察结果。pcr产物的纯化和测序工作由大连宝生物有限公司完成。1.3.3.3 16s rdna序列比对与系统进化树构建 经1.3.3.2

49、步实验所得的16s rdna序列首先进行blast同源性比对，再利用cluatal x软件对扩增序列与genbank中近缘种的序列进行缺省参数的对位排列，然后用mega 4.0软件构建进化树。1.3.4 不同环境温度下菌株a的生长接种菌株于lb培养基中，在37恒温摇床120rpm上过夜增菌。取扩增的菌液于50ml灭菌锥形瓶中（含20ml lb培养基），接种菌量为50l。将上述培养物分别置于20、25、30、35、40恒温温箱中培养12h后，用722分光光度计测定od600值，同时以灭菌lb培养基为空白对照。1.3.5 不同渗透压下菌株a的生长配置nacl含量分别为0.5%、1%、3%、5%、7

50、%、9%的lb培养基。分别接种50l新鲜菌液，在37恒温摇床上120rpm培养12h，分别测定od600值，同时以灭菌lb培养基为空白对照。1.3.6 不同ph值时菌株a的生长 配置ph为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的lb培养基。分别接种50l 新鲜菌液，在37恒温摇床上120rpm培养12h，分别测定od600值，同时以灭菌lb培养基为空白对照。1.3.7 菌株a的保存根据不同的使用目的，对菌株采取不同的保存方法。1.3.6.1 平板保存法取15l新鲜菌液进行平板涂布，置入温箱培养至肉眼可见的菌落，放入4冰箱保存。普通营养琼脂平板的保存时间一般为1-4周。1.3.6

51、.2 甘油保存的方法将新鲜菌液与灭菌甘油以13（v/v）混匀，在-4冰箱保存半小时，再转移至-20冰箱中预冻2小时后转入-80低温冰箱中冷冻保存。该法可保存细菌12年。2 结果与分析 2.1 pcp降解菌驯化、分离结果本实验采用活性污泥曝气、密度梯度驯化法，以pcp为唯一碳源，连续驯化8周，经分离纯化后得到3株优势菌，分别命名为a，b，c。这3株优势菌在含pcp的lb固体培养基上的菌落形态特征见表1-3。表1-3 菌落形态特征table 1-3 the characteristic of colonial morphology菌株编号菌落颜色菌落形态含pcp的lb固体培养基培养时间（h）a透明

52、圆形，扁平，顶部有凸起约24b乳黄色较大，周围不光滑约32c乳白色细小，圆形，表面光滑约242.2 pcp高效降解菌的筛选2.2.1 pcp高效液相色谱标准曲线不同浓度下pcp的色谱峰面积见表1-4，根据表1-4 pcp色谱峰面积y与浓度x的回归方程为：y=73.711x+2.6348，r2 =0.9903。空白组pcp的回收率为：96%104%。表1-4 标准样品的色谱峰面积table 1-4 chromatogram peak area of the standard pcp sample标准样品浓度（g/l）pcp色谱峰面积0.0242.450.0363.600.1211.490.242

53、2.640.3632.460.647.150.859.342.2.2 不同降解菌对pcp的降解率经分离纯化得到3株菌（a，b，c），并对这3株菌进行筛选。分别降解pcp浓度为200mg/l的降解用无机盐培养液，30恒温摇床150r/min培养48h，不同降解菌对pcp 降解率见表1-5。菌株a的降解效果最好，48h的降解率为98.6%，菌株c次之，降解率为85.3%，菌株b的降解能力较差为63.3。因此，选择菌株a作为实验的高效降解菌株，进行后续pcp降解研究。表1-5 不同降解菌对pcp的降解率table 1-5 biodegradation rates of the 3 strains b

54、acteria on pcp样品编号pcp峰面积降解率（%）空白对照33.450a2.0798.6b13.3763.3c6.3285.32.3 菌种鉴定2.3.1 菌株a的生理生化特征高效降解菌a为革兰氏阴性菌，呈短杆状，无芽孢，无鞭毛，菌体大小为0.71.3m。在普通琼脂平板上培养24h可出现球形菌落，透明，边缘光滑，顶部有小凸点。菌株a的生理生化特征鉴定见表1-6。2.3.2 分子生物学鉴定16s rdna是编码原核生物核糖体小亚基rrna的基因，是细菌分类研究中最常用和有用的“分子钟”，其序列包含可变区与恒定区，可变区因细菌而异，变异程度与细菌的系统发育密切相关36。与23s rdna等相比，它具有分子量适中、突变率小等优点，素有“细菌化石”之称。是种属鉴定的分子基础，在细菌种属分类鉴定中广泛应用37。以菌株a的基因组dna为模板扩增其16s rdna基因，扩增产物片段通过1%的琼脂糖凝胶电泳得到长度约700bp的dna片段，经凝胶仪成像得到的图谱见图1-1。将菌株a 16s rdna的pcr产