HPV基因分型检测试剂盒常见问题【行业研究】

1、HPV基因分型检测项目临床试验实际问题,1,谷风优质,目 录,试验开展实验室要求 HPV临床样本的采集方法及注意事项 临床试验操作注意事项 临床试验结果分析及常见问题,2,谷风优质,HPV基因分型检测试验项目 试验开展实验室要求,3,谷风优质,临床基因扩增实验室设置的一般原则,各区独立 注意风向 因地制宜 方便工作,“十六字方针”,4,谷风优质,基因扩增检验实验室工作流程,进入各个工作区必须遵循严格的单一方向顺序!,5,谷风优质,最佳的HPV基因分型实验室布局,出口,入口,工作流向,临床 样本 收集 与 储存,PCR前区域,PCR后区域,6,谷风优质,最佳的HPV基因分型实验室布局,每间房间必

2、须有其专用的工作服及一次性手套； 每个工作区都应有独立的一套仪器设备及耗材； 不同区域的仪器设备及耗材不能混用;,临床样本 (原始容器中),样本制备区,试剂准备区,超净工作台,DNA 提取,PCR 扩增区,导流 杂交区,结果通知患者,7,谷风优质,基础HPV基因分型实验室布局（1）,临床样本 (原始容器中),样本制备区,超净工作台,DNA 提取,导流 杂交区,结果通知患者,PCR区域,8,谷风优质,基础HPV基因分型实验室布局（2）,每个区域必须有其专用的工作服及一次性手套；每次操作必须更换； 涉及到公用仪器使用，必须注意防止交叉污染，定时使用次氯酸钠溶液擦洗；,9,谷风优质,实验室环境注意事

3、项,工作区域必须始终保持清洁整齐； 所有实验台面及地面均应保持清洁； 所有实验废料及垃圾使用专用垃圾带装好后，封口处理； 在每次工作前后对工作台面进行消毒液（次氯酸溶液）擦洗、消毒酒精擦洗工作，并在完成工作后开启紫外灯进行灭菌；,10,谷风优质,实验室制度及人员配备,有效的临床结果,严格规章制度 并遵守,操作人员具有 专业技术知识 和经验,强烈责任感 工作态度 认真细心,严格遵守 HPV基因分型 各项工作的 标准操作规程,11,谷风优质,实验所需仪器,HybirMax医用核酸 分子快速杂交仪,PCR扩增仪,超净工作台,水浴锅,离心机,旋涡混合仪,微量移液器,12,谷风优质,HPV基因分型检测试

4、验项目 HPV临床样本的采集方法及注意事项,13,谷风优质,HPV临床样本的采集方法及注意事项,标本收集 标本保存,14,谷风优质,标本收集,检查前告知病人注意事项： 月经正常妇女，在月经来潮后1018天为最佳检查时间。 检查前48小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物。 检查前48小时最好不要行性生活。 检查前不进行醋酸或碘液涂抹。,15,谷风优质,标本收集,步骤 先脱掉裤子，然后按医生指示仰卧于一张检查床上。,步骤二 由医生以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈。 然后使用专用的HPV采样刷置于宫颈口采集标本。（最好在取样前先用棉签擦去宫颈分泌物）,16,谷风优质,标本收集,步骤四 慢慢

5、取出宫颈刷，将其放入标有病人编号的取样管中，取样管内已加有专用细胞保存液，折断其刷头入管中，拧紧瓶盖。,步骤三 将专用宫颈刷置于宫颈口，轻轻搓动宫颈刷使其顺时针旋转5圈。,17,谷风优质,标本保存,样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。 如若不能马上送检样本，请于4保存，请在2个星期之内进行检测。,18,谷风优质,标本收集,标准收集中注意事项： 使用凯普专用取样器及保存液，可抑制细菌生长，保持DNA完整性。 样本收集中为保留足够的宫颈细胞标本，注意切勿将宫颈刷头丢弃。 宫颈保存系统包装打开后，必须立即进行采样，并连同刷头置于取样管中。 如果同时进行细胞学检查，应先采细胞学样品。 宫颈刷头

6、折断、试验取样时，请小心操作，切忌大力震荡取样管，造成试剂及样本溅出影响检测结果或造成污染。 取样管上标示的名称须与患者一一对应。 取样后，切记拧紧取样管管盖。,19,谷风优质,HPV基因分型检测试验项目 临床试验操作注意事项,20,谷风优质,因操作欠规范导致的问题分析,21,谷风优质,移液器：,严禁大力来回拧动； 严禁调至容量之外使用； 第二档为排空档，不得作吸取之用； 吸头应浸入液面23mm处吸取； 严禁将有液体的移液器平放或倒置； 混匀沉淀时，将吸头紧贴于沉淀上方管壁，反复吸取液体，将沉淀反复混匀，溶解； 每周用75%乙醇清洗一次，若有污染随时清洗。,22,谷风优质,（二）实验室布局不合

7、理引起的污染问题,1、样品处理不进行隔离，样品中各种核酸片 段均会通过空气进行传播。 2、PCR结果检测实验室和其它实验室在一 起，会出现严重的扩增子污染。 3、仪器设备及工作服等（尤其是加样器）公 用，也会造成严重污染。 4、实验室操作垃圾（吸头、离心管、样品杯 等）乱 放，飘散在空气中的核酸片段、病原微生物可造成实验室 污染。,23,谷风优质,（三）PCR操作中存在问题分析,1.阳性变阴性 2.阴性变阳性 3.PCR结果不稳定,24,谷风优质,1.阳性变阴性,(1) 有些阳性病人，经过PCR检测后为阴性，可能有两种情况： 一是采集标本方法或部位不正确， 二是如果病人取样部位病原体消失，需根

8、据病人的病理情况采样。,25,谷风优质,(2) 标本保存不当，可引起PCR失败。 收集的标本乱放（未放冰箱），病原体的破裂，检测的核酸降解，失去了PCR检测的模板或造成标本污染。,26,谷风优质,2.阴性变阳性 常见的原 因有以下5点：,27,谷风优质, 加样器通道易形成气溶胶，造成加样器通道污染，可通过使用有滤筛的吸头避免污染 （将模板DNA加入PCR系统时，注意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的反应，所有并非即用管都应盖严）。,28,谷风优质, 打开标本管盖引起样品飞溅 （打开前须瞬间离心） 操作时手套引起的交叉污染 （拿过模板DNA管后应更换手套）,29,谷风优质, 不明原因引起公用试剂污

9、染 （必须设置一个不含模板DNA但含PCR系统中所有其他成分的对照反应。这一对照管须在准备好所有其他PCR以后才进行吸加）。 实验室污染,30,谷风优质,临床试验操作注意事项,实验室建设方面 HPV分型检测试验操作方面 DNA提取 PCR扩增 导流杂交 (详见各项操作的SOP）,31,谷风优质,临床试验操作注意事项 实验室建设方面,一、实验室分独立房间操作: 样本储存区（与试剂储存分开） PCR前区域 (试剂贮存及准备区, 样本处理区) PCR后区域 (PCR扩增产物分析区) 仪器及耗材独立使用，切忌前后区域交叉！试验工作服及手套独立 二、单一工作流程: PCR前区域 PCR后区域 三、实验室

10、环境 （防止污染、保持清洁整齐、严格制定及执行各项规章） 四、试剂管理及标本管理 试剂按要求温度贮存、注意有效期，使用过的试剂拧紧归类放好； 样本清楚标记好样本号、与试剂分开贮存，使用过的样本归类放好 五、以谨慎的态度对待，并清楚记录实验結果及一些突发性问題；,32,谷风优质,临床试验操作注意事项 DNA提取,使用移液器吸取临床样本时，避免移液枪头碰到样本管壁。所用移液枪头均为一次性用品，切忌重复使用；,防止造成样本交叉污染,防止造成试剂被污染,正确使用移液器,33,谷风优质,临床试验操作注意事项 DNA提取,尽可能使用带有滤心的移液器枪头,防止形成气溶胶污染实 验室环境,防止样本DNA污染

11、移液器枪管,34,谷风优质,临床试验操作注意事项 DNA提取,DNA提取操作步骤注意事项： 加入溶液之前, 应确保溶液中没有沉淀出现! 以免影响提取效率. 加入临床样本时,最好在超净工作台前操作,且将用过的枪头打入到盛有10次氯酸钠的废液瓶中, 以免样品交叉污染,影响以后的PCR检测. 在煮沸样品时,切记不要让沸水溅入到样品管中!建议水沸腾后调低火力. 每次去上清时,尽量去干净,特别是第3步骤, 以免影响提取效果. 在做PCR之前,最好将提取的样品离心5分钟, 取样时尽量不要将枪尖碰到管底的沉淀。,35,谷风优质,临床试验操作注意事项 PCR扩增,正确使用移液枪,防止造成样本交叉污染,防止造成

12、试剂被污染,36,谷风优质,临床试验操作注意事项 PCR扩增,尽可能使用带有滤心的长头移液器枪头,防止形成气溶胶,防止样本DNA交叉污染,防止样本污染试剂,37,谷风优质,临床试验操作注意事项 PCR扩增,防止造成试剂被污染 移液枪头均为一次性用品,切忌重复使用 移液枪头尽可能为带有滤芯 每个区域必须用专用仪器、耗材。 进入不同房间必须穿专用工作服及带手套，离开时必须先脱去工作服及手套。 PCR后操作区域房间内的所有耗材及仪器均不能与PCR前区域混合使用。 使用前后均以次氯酸消毒液清理。,38,谷风优质,临床试验操作注意事项 PCR扩增,HPV 58,HPV 18,HPV 16,PCR操作不当

13、造成污染：,39,谷风优质,临床试验操作注意事项 导流杂交,杂交及杂交后清洗溫度（45C ）。 每次清洗膜后，抽液干净。 确保PCR产物变性成功。 遵守封阻反应温度及时间、酶标反应时间及显色反应时间，确保杂交结果背景正常。 正确使用移液器，移液枪及枪头专用。,40,谷风优质,HPV基因分型检测试验项目 临床试验结果分析及常见问题,41,谷风优质,临床试验结果分析及常见问题,HPV阳性正常结果,HPV阴性正常结果,42,谷风优质,临床试验结果分析及常见问题,一、杂交结果中IC点不清楚，同时阳性点也不清楚或比较淡； 可能原因： 杂交温度控制不当，出现非特异性杂交点； DNA样本中有对PCR反应的抑

14、制物质，影响了 PCR扩增的效率； 确保PCR产物完全变性成单链，如有必要，在使 用前再次变性PCR产物。 病人样本是否取样前是否违反了取样要求？ 将DNA样本稀释10倍后，重新PCR扩增及杂交反应可解决。,43,谷风优质,临床试验结果分析及常见问题,二、杂交结果中，在杂交膜上既无IC点，也没有HPV分型阳性点显色； 可能原因：可能是因为DNA模板中存在抑制PCR反应的抑制物质，首先, 通过抽提得到的DNA的纯度对PCR反应会有很大影响,所以必 须在做PCR模板的时候将其稀释从而降低DNA溶液中抑制剂的 浓度,使得PCR反应能正常进行，在一家新的医院开始试验的时 候均需要摸索本院样本自身的特点

15、。 或者所取样本，不符合凯普HPV分型检测说明书中对样本的 要求，样本之前经过碘染色或者病人使用了阴道冲洗药物，均 会对PCR反应产生抑制。 确保PCR产物完全变性成单链，如有必要，在使用前再次变 性PCR产物。 如果这些情况的时候，建议对样本稀释10倍重新PCR，然后杂交， 结果仍然不成功的情况下，建议按照凯普说明书要求重新取样 检测。,44,谷风优质,临床试验结果分析及常见问题,402721,403022,403040,403078,稀释 1:10 DNA模板重复PCR,45,谷风优质,临床试验结果分析及常见问题,三、杂交结果中IC点没有，同时阳性点淡或不清楚； 可能原因： 样本中含有抑制

16、PCR反应的物质； 样本中HPV DNA浓度较低，同样本中 含有抑制PCR反应的物质； 病人样本不符合凯普分型试验要求，样本本身 为阴性结果，但因为样本中有抑制PCR反应的物 质，同时操作人员对杂交温度又控制不当，出 现非特异性杂交点； 建议增加用于扩增DNA浓度，重新PCR扩增及杂交反应。,46,谷风优质,临床试验结果分析及常见问题,四、IC点弱或者没有，但HPV分型阳性点显色正常 可能原因： 由于IC和HPV DNA之间存在竞争，高 浓度的HPV DNA可能会对IC点的扩增反 应产生竞争性抑制，此现象出现时如 HPV分型点显色正常，则认为分型结果 正确。,47,谷风优质,临床试验结果分析及

17、常见问题,六、Biotin（生物素）点不显色 可能原因：请确认所使用试剂是否仍在有 效期内。尤其是酶标液及显色 液是否按要求使用及储存。 确定实验操作是否严格按照说 明书进行、且试剂是否按要求保 存使用。,48,谷风优质,临床试验结果分析及常见问题,七、阴性对照显现HPV分型阳性点 可能原因：PCR试剂可能被污染，取5 l PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电 泳分析。 重复进行PCR及杂交试验,。,49,谷风优质,临床试验结果分析及常见问题,八、杂交膜有很高的背景 可能原因：可能由于封闭不足，使未结合 的酶标残留在膜上。确保封闭液 完全覆盖整个杂交膜。 也可能因为没有完全将未结合 的试剂清洗干净，

18、请确保在显色 过程中杂交膜充分清洗，无剩余 残留液体。,50,谷风优质,临床试验结果分析及常见问题,九、封阻液抽不动 可能原因： 仔细观察封阻液是否有絮状微 生物或澄淀，如果有则证明封阻 液有发霉迹象，是由于操作中没 有使用灭菌枪头而造成的。 重新购买封阻液，同时确保试验中使用已灭菌的移液枪头,51,谷风优质,临床试验结果分析及常见问题,十、什么时候需要做阳性及阴性对照 当一个新的医院，一个新的地方开展试验的时候，或更换试验地点的时候，需要进行阴阳性对照试验； 当使用的检测试剂批次改变的时候需要做1次阴阳性对照； 当杂交结果出现令人疑惑，比如多个样本的杂交结果一样，或者杂交结果出现过多的多重感染，以及杂交试验后出现许多无IC点及阳性杂交点的结果等情况下，需要使用同批试剂进行阴阳性对照试验以验证问题所在；,52,谷风优质,临床试验结果分析及常见问题,十一、导流杂交试验中的污染主要会出现在那一步中，应该怎样防范？ 首先，污染情况主要由PCR操作中样本DNA的交叉而产生；对于此种情况，应严格按照SOP操作，确保PCR加样的试验器材均为专用，特别是移液枪和枪头。 其次，杂交结果中出现的比较弱的杂交点不是污染造成，而是杂交温度不符合要求而造成的非特异性点。对于此种情况，应在杂交操作的时候，确