酶的结构与功能

1、第二章 酶的结构与功能,Enzyme,主要内容 主要介绍酶的概念、催化特性及其化学本质，讨论酶的结构特征和催化功能以及酶的作用机理，进而讨论影响酶作用的主要因素。,重 点 酶促反应动力学（影响酶反应的因素）；酶的作用机理,难 点 激活剂、抑制剂的影响；别构调节,酶的发现及研究历史,人们对酶的认识起源于生产与生活实践。 夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。 公元前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。 春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。 酶者，酒母也,第一节 酶引论,enzyme (in yeast),enzyme是希腊文 en = in ， zyme = yeast,什么是酶？,酶是生物

2、催化剂 生物体一切生化反应都需酶催化才能进行！ 性能远远超过人造催化剂 定义：由活细胞产生的、 有高度专一性和 高效催化作用的生物大分子。,一、酶是生物催化剂,1.只能催化热力学上允许进行的反应； 2.提高反应速度，不改变平衡点; 3. 只起催化作用，本身不消耗； 4. 降低反应的活化能。,（一）与一般催化剂相同的特点,一般催化剂 反应活化能,反应总能量变化,酶促反应活化能,非催化反应活化能,初 态,终 态,能 量 改 变,活 化 过 程,酶促反应活化能的改变,过渡态,活化能(activation energy) 指在一定温度下，1mol底物全部进入活化态所需要的自由能 单位：KJ/mol,酶

3、催化反应的实质：,降低反应的活化能,1. 高效性,且无副反应,反应速度是无酶催化/普通人造催化剂催化反应速度的1051017倍。,（二） 生物催化剂的特点,铁屑 肝糜 肝糜(煮),例：双氧水裂解,2.专一性,Specificity: 酶对催化的反应和反应物有 严格的选择性。,底物（substrate): 酶作用的物质。,（1）酶浓度的可调性 （2）通过激素调节酶活性 （3）反馈抑制调节酶活性 （4）抑制剂和激活剂 （5）别构调控、共价修饰、同工酶等,3. 可调节性,为P所抑制 A B C D P（终产物） 图 通过终产物可逆的结合对途径中的第1个酶反馈抑制,4.反应条件温和（易失活）,常温、常

4、压、中性,5.催化活性与结构有关,生物固氮：,工业氨合成：,二、酶的化学本质及组成,经酸碱水解终产物是AA 能被蛋白酶水解而失活 酶可变性失活 酶是两性电解质 具有不能通过半透膜等胶体性质 具有蛋白质的化学呈色反应,化学本质是蛋白质,（一）酶的化学本质,1982年T.Cech发现了第1个有催化活性 的天然RNAribozyme（核酶）， 以后又陆续发现了真正的RNA催化剂。,1995年，Jack W. Szostak 研究室首先报道了具有DNA连接酶活性的DNA片段，称之为脱氧核酶(deoxyribozyme)，为生物催化剂的发展作出了新的贡献。,单纯酶 ：只有蛋白质 缀合酶（结合酶）：脱辅酶

5、 + 辅助因子,辅助因子,辅基（prosthetic group）,辅酶（coenzyme）,与酶结合紧,与酶结合松,全酶,（二）酶的化学组成,根据酶的组成成份：,羧肽酶,缀合酶中： 单独酶蛋白或辅助因子没有催化活性 一种酶蛋白一般只与一种辅助因子结合 同种辅助因子可与不同的酶蛋白结合,酶蛋白：决定反应的专一性 辅助因子：传递电子、原子或某些 化学基团的作用,monomeric enzyme：一般由一条肽链组成 oligomeric enzyme：为寡聚蛋白，2个亚基 multienzyme complex：几种酶靠非共价键 彼此嵌合而成。酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应, 有利于提高酶

6、的催化效率并便于对酶的调控。 （如糖代谢、脂代谢）,（三）单体酶、寡聚酶、多酶复合体,根据酶蛋白分子的特点：,三、酶的命名和分类,（一）习惯命名法,根据其催化底物来命名； 根据所催化反应的性质来命名； 结合上述两个原则来命名， 有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点。,（略讲）,优点 命名简单 应用历史较长，使用方便 缺点一名数酶、一酶数名 为了适应酶学发展的新情况，国际酶学会议于1961年提出一个新的系统命名法及分类原则，已被国际生化协会采用。,（二）国际系统命名法：,系统名称包括底物名称、反应性质，最后加一个酶字。,底物1 ：底物2 + 反应性质+酶,乳酸 + NAD+,丙酮酸 + N

7、ADH + H+,乳酸：NAD+氧化还原酶,当底物为水时，可省略,系统名：包括所有底物的名称和反应类型。,惯用名：只取较重要的底物名称和反应类型。,对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。,（三）国际系统分类编号,1961年国际酶学委员会（Enzyme Committee, EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：,氧化-还原酶催化氧化-还原反应，催化氢的转移或电子传递。 主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。 如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。,1、氧化还原酶 Oxidoreductase,（四）六大类酶的特征,（1）

8、脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应,（2）氧化酶类,催化底物脱氢，氧化生成H2O2：,催化底物脱氢，氧化生成H2O：,（3）过氧化物酶,（4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）,转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。 根据X分类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。 例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。,2、转移酶 Transferase,水解酶催化底物的加水分解反应。 主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。 例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：,3、水解酶 hydrolase,裂合酶催化从底物分子中移去一个基

9、团或原子形成双键的反应及其逆反应。 主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。 例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。,4、裂合酶 Lyase,异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。 例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应,5、异构酶 Isomerase,P,P,合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。 例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸,6、合成酶 Ligase or Synthetase,酶的系统编号：4位数字 第一位：代表六大类反应类型 第二位：亚类（作用的基团或键的

10、特点） 第三位：亚亚类（精确表示底物/产物的性质） 第四位：在亚亚类中的序号,指酶对底物的选择性，也称特异性。,结构专一性,立体专一性,绝对专一性,相对专一性,基团专一性,键专一性,旋光异构专一性（D-、L-）,几何异构专一性(顺、反异构),四、酶的专一性,（一）酶的专一性,基团专一性,胰蛋白酶,（1）锁钥学说刚性构象 （2）诱导契合学说 （3）三点附着学说 立体异构专一性的酶,（二）与酶专一性有关的学说,锁钥学说,认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样,“三点结合”的催化理论,酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全

11、结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。,诱导契合学说,酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.,（Koshland，1958）：当底物和酶接触时，可诱导酶分子的构象变化，使酶活性中心的各种基团处于和底物互补契合的正确空间位置，有利于催化。,（三）研究酶的专一性的意义,理论上，专一性弱键和结构互补成为理 解生物大分子之间相互作用的基石。 实践上也有重要意义。例如，某药物具有某 一种构型才有生理效用，而有机合成的是消旋混 合物, 若用酶可以进行不对称合成或不对称拆分, 即得到单一构型的药物。,五、酶的活力测定和分离纯化,（一） 酶活力与酶促反应速度

12、,1、酶活力（enzyme activity）,酶活力就是酶催化某一化学反应的能力。可以用它催化某一化学反应的速度来表示。,酶活力的大小代表酶的量,2.活力单位 (U),酶单位（U）： 在一定条件下、一定时间内、将一定量的 底物转化为产物所需的酶量。 如： 每小时催化1克底物 每小时催化1ml某浓度溶液 每分钟催化1ug底物,一定时间,一定量底物,一定条件下,在标准条件下（25 ，最适pH和最适底物浓度）一分钟内催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。 1 IU= 1 mol / min 酶活力单位标准化,（1）国际单位（IU）,在标准条件下（25 ，最适pH和最适底物浓度）每秒钟催化1摩尔底物

13、转化为产物所需的酶量。 1 Kat =1 mol/s = 60106 IU = 6107 IU 1IU =（1/60）Kat = 16.7nKat 酶活力单位标准化,（2）Kat,每mg酶蛋白所含的酶活力单位数。 U/mg酶蛋白、 U/ml酶蛋白 酶产品质量评价中常使用，一定程度上代表酶的纯度。,（3）比活力 (specific activity),比活力越大，酶的纯度越高,一定条件下： 每秒钟、每个酶分子转换的底物分子数 或每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数 一秒内1摩尔的酶可催化几摩尔的底物,（4）转换数（turnover number，TN）,反应酶的催化活性中心的活性,用哪一个速度来表示

14、酶促反应的速度特征呢？,反应初速度 Vo,逐渐降低,酶反应进程曲线,在酶促反应开始无任何干扰因素出现时, 短时间内酶的反应速度。 一般指反应底物消耗5%以内时的反应速率 。,3. 酶促反应速度,单位时间内底物(S)的减少量或产物(P)的增加量,Why?,反应速度逐渐降低的原因：底物浓度的降低； 产物的生成逐渐增大了逆反应； 酶在反应中失活； 产物对酶的抑制,反应初速度表示酶活力,（二）酶活力的测定酶反应速度的测量,测量单位时间内底物的消耗量。 测量单位时间内产物的生成量。,浓度,时间,产物P,反应物S,（1）应测反应初速度（initial velocity） 底物浓度变化在起始浓度5%以内。,

15、（2）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增 加量来表示。,（3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。,（4）测定酶反应速度时，应使SE。,1、测定酶活力的注意事项,2、 酶活力的测定方法,（1）分光光度法（spectrophotometry）,该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。,优点：简便、迅速、准确；一个样品可多次测定；可检测到10-9mol/L水平的变化。,例: 人血清乳酸脱氢酶活力的测定,（2）荧光法（fluorometry）,该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。,主要的优点：灵敏度很高，可测10-12mol/L的样品。,酶蛋白分子中的Ty

16、r、Trp、Phe残基以及一些辅酶、辅基，如NADH NADPH、FMN、FAD等都能发出荧光。,（3）酶偶联分析法(enzyme coupling assay),第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个酶系统在一起反应。,P1无光吸收或荧光变化，偶联后, P2有光吸收或荧光变化。,例：测己糖激酶的活性,（4）电化学法（electrochemical method）,有pH测定法、离子选择性电极法等。,离子选择性电极法要求在酶反应中必须伴随有离子浓度的变化或气体的变化（如O2、CO2、NH3等）。,例: 葡萄糖氧化酶活性的测定,（5）同位素法,放射性同位素标记底物，经酶作用得到相应产物，经适当分

17、离，测定产物脉冲数即可。,酶活力测定实例,确定反应条件 20、pH=7，底物浓度 6g/l（过量）， 加入2mg固体脂肪酶 确定活力单位 每小时催化1克底物 1u= 1g/h 测反应初速度 作产物甘油随时间增加的曲线， 量出反应初速度值 ， 换算为脂肪的消耗速度。如 8g/h 换算活力 8g/h / 1g/h=8u 计算比活 8u/2mg酶蛋白=4u/mg酶蛋白,分离纯化方法同蛋白质纯化类似： 1.选材：酶含量丰富的新鲜生物材料 2.细胞破碎：因材料而异,3.抽提：低温下以水或低盐缓冲液抽提 4.分离及纯化：粗分级，细分级分离,5. 结晶 6.保存：低温下酶粉可长期保存,注意低浓度酶溶液易变性

18、,（三）酶的分离和纯化,酶的分离纯化,溶解度的差异,盐析法 PEG沉淀法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法,热稳定性的差异,热处理沉淀法,电荷性质的差异,离子交换层析法 电泳法,分子大小和形状的差异,凝胶过滤法 超滤法 透析法 离心法,亲和力的差异,亲和层析法,疏水作用的差异,疏水层析法,分配系数的差异,双水相系统萃取法,由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意 :,1全部操作在低温04。,2在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。,3在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、 少量-巯基乙醇及蛋白酶抑制剂。,4在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力和回收率（得率）。,酶的

19、纯度： 总活力 = 活力单位数/ mL酶液总体积（ mL） 比活力 = 活力单位数/ 毫克蛋白,酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、分子筛层析等。,衡量分离提纯效果的两个指标 总活力的回收得率（回收率） 是表示提纯过程中酶的损失情况 比活力提高的倍数 是表示提纯方法的有效程度,酶的分离纯化过程中一定要随时追踪酶的活性,六、非蛋白质生物催化剂核酶（ribozyme),1982年美国科学家Altman和Cech研究Tetrahymena thermophiea（ 嗜热四膜虫） rRNA前体加工成熟时，发现具有催化活性（自我剪切功能）的天然RNA。,1983年美国S.Altman等研

20、究 E.coli RNaseP（由23%蛋白质和77%的RNA组成），发现RNaseP中的RNA可催化E.coli tRNA的前体加工。,（一）核酶的发现,1986年，T. Cech又发现 L19 RNA 在一定的条件下能以高度专一性方式催化寡核苷酸底物的切割与连接。 基于Cech和Altman的创造性工作，将这类具有酶一样的催化功能，本质上不是蛋白质而是RNA的生物大分子定义为Ribozymes。 该发现曾被认为是生化领域内最令人鼓舞的发现之一，为此Cech和Altman共同荣获1989年度诺贝尔化学奖。,随后的研究表明： L19RNA具备酶促催化的几个特征： 高度的底物专一性 遵循Mich

21、aelis-Menten动力学 对竞争性抑制剂的敏感性,(2) 1992年，Piccirilli等发现L19RNA具有氨酰酯酶的活性，催化氨酰酯水解。 (3) L19RNA还有限制性内切酶作用： -CpUpCpUpN- + G -CpUpCpU +GpN,(4) 1997年，Zhang和Cech用人造的RNA分子催化合成了肽链，表明RNA具有肽基转移酶活性。 (5) 原核生物RNaseP和兔肌1，4- -葡聚糖分枝酶,均包括RNA+蛋白组分， 起催化作用的都是RNA。,（二）核酶的种类 自我剪切:是转录后加工方式之一 （self- cleavage） 自我剪接: （self-splicing）

22、,I型内含子：需要鸟苷和Mg2+参与,II型内含子：不需要鸟苷的参与,剪切与连接,催化分子内反应,催化分子间反应：,按作用底物,如RNase P、L19RNA,自我剪切核酶包括：发夹结构核酶、锤头结构核酶、丁型肝炎病毒（HDV）核酶等。,（1）发夹结构核酶,由4个螺旋区和数个环状区组成,切割活性所需最小长度为50个核苷酸,螺旋、决定核酶切割部位的特异性，螺旋配对碱基及其3端的未配对碱基均为切割活性所必需,结构特点,结构特点,三个螺旋,13个保守碱基,剪切点：GUN,（2）锤头结构核酶,（3）HDV核酶和VS RNA,（三）核酶的研究意义与应用前景,1、研究意义,突破了生物体内所有的“生物催化剂

23、都是蛋白质”的传统观念； 对生命起源这一问题有了新的认识 ； 从生物进化角度来看，生物催化剂从核酶到蛋白质的转变，伴随着生物代谢高效率和生命现象的更趋复杂。,2、应用前景,可以设计出自然界不存在的各种核酶。,核酶基因研究前景诱人，在基因治疗领域中倍受青睐，其研究进展也相当迅速。,酶工程就是利用酶的特异催化功能，对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。包括： 化学酶工程：(酶学+化学工程技术) 利用化学工程手段，改善酶的性能，提高催化效率, 降低成本。包括：天然酶、化学修饰酶、固定化酶、人工酶 生物酶工程：(酶学+现代分子生物学技术) 以DNA重组技术为核心。包

24、括：克隆酶、突变酶等。,七、酶工程,化学酶工程 酶分子表面的修饰，酶分子内部的修饰，化学合成人工酶 。 1、微生物发酵得到粗酶 2、对天然酶进行化学修饰、固定化处理， 利用化学合成等手段来改善酶性能。,天然酶,利用化学的手段对酶分子上的氨基酸侧链基团进行修饰，改善酶的性能，以适用于工业的应用及研究工作的要求。 1、酶化学修饰的基本方法 （1）酶分子侧链基团的化学修饰 修饰酶的功能基团： -NH3、 -SH、 -COOH 、咪唑基、酚羟基、吲哚基、胍基、甲硫基等。 修饰反应：酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、芳香环取代反应等类型。,（一）化学修饰酶,其中水溶性的碳二亚胺类 特定修饰已成为最普

25、遍的标准方法。可以在较温和的条件下进行，但一定条件下，Ser、Cys和Tyr也可反应。,羧基的修饰,R,R为烷基，HX 为卤素、一级或二级胺；ENZ为酶,Lys的-NH2可采用烷基化反应来修饰。修饰剂包括有乙酸酐、卤代乙酸、芳基卤和芳香族磺酸。其中，三硝基苯磺酸（TNBS）是种非常有效的氨基修饰剂。反应后在420nm和367nm能够产生特定的光吸收。,氨基的修饰,此外，磷酸吡哆醛（PLP）、氰酸盐、及蛋白质测序中用的DNS（丹磺酰氯）、苯异硫氰酸酯（PITC）都可作为修饰剂。,具有两个邻位羟基的化合物。如丁二酮、1，2-环己二酮、苯异二醛，都是重要的修饰剂。,胍基的修饰：,烷基化试剂是一种酶修

26、饰剂，如碘乙酸。修饰产物相当稳定，易于分析。此外，马来酸酐、马来酰亚胺等修饰剂与巯基形成对酸稳定的衍生物。 2-硝基苯甲酸（DTNB），与-SH反应形成S-S，释放出一个2-硝基-5-硫苯甲酸阴离子。在412nm处有最大吸收。因而能通过光吸收的变化跟踪反应程度。,巯基的修饰,有机汞试剂（如对氯汞苯甲酸）对巯基专一性强，反应物在250nm处有吸收,常用的修饰剂有，焦碳酸二乙酯（DPC）、碘代乙酸， 能修饰咪唑基的两个N原子。,ENZ,+,+ CH3CH2OH + CO2,His咪唑基的修饰,O,N,NH,ENZ,C,O,C,O,O,CH2CH3,O,CH2CH3,+,pH4-7,ICH2COO-

27、,pH5.5,Trp残基一般位于E分子内部，而且比-SH、-NH2等一些亲核基团的反应性差。所以一般不与常用的一些试剂反应。 N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）可以修饰，并通过280nm处光吸收的减少跟踪反应。,色氨酸吲哚基的修饰,Tyr的修饰包括-OH和芳环上的取代修饰，Thr和Ser残基的-OH都可被酚羟基的修饰剂修饰，但反应条件严格些，生成的产物也更稳定。 四硝基甲烷（TNM）在温和条件下可高度专一性地硝化酚羟基生成可电离的发色基团3-硝基酪氨酸，在酸水解条件下稳定，可用于氨基酸定量分析。,酪氨酸残基和脂肪族羟基的修饰,甲硫氨酸甲硫基的修饰,过甲酸,甲硫基的化学修饰,碘乙酰胺,甲硫氨酸残基极性

28、较弱，在温和条件下很难选择性修饰。但是由于硫醚的硫原子具有亲和性，可以用过氧化氢、过甲酸等氧化成甲硫氨酸亚砜。,（2）酶的化学交联,交联剂是具有两个反应活性部位的双功能基团可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或酶与其他分子之间发生交联反应。 同型双功能交联剂:两端具有相同的活性反应基团。可与氨基反应的双亚氨酸酯是一个典型的同型双功能交联剂。此外，N羟琥珀酰亚氨酯、二硝基氟苯等。 异型双功能交联剂：一端与氨基作用，另一端一般与巯基作用。但是用碳二亚胺时，第二个反应基团是羧基。 可被光活化的高交联剂：一端与酶反应后，经光照，另一端产生一个活性反应基团（自由基）如碳烯或氮烯，它们具有高反应性，没有专

29、一性。,使用双功能试剂如戊二醛、PEG等可将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链之间进行共价交联，使酶分子活性结构得以加固，提高其稳定性。 交联酶晶体技术可以大幅度提高酶的生物活性和热稳定性。并且发现交联晶体在有机溶剂中的催化活性和稳定性提高。,例如，糖基化作用于交联技术联合使用应用于青霉素G酰化酶，利用葡聚糖二乙醛将青霉素G酰化酶交联，55 下半衰期提高9倍，Vmax 不变。 此外，丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶等亦可通过交联修饰由常温酶变为嗜热酶，温度从45 提高到76,对修饰剂的要求：修饰剂具有较大的相对分子质量，良好的生物相容性；分子表面有较多地反应活性基团及修饰后酶活的半衰期较长。,（3

30、）大分子结合修饰,常用的化学修饰剂,A、糖及糖的衍生物主要有右旋糖酐、右旋糖酐硫酸酯、糖肽、葡聚糖等； B、高分子聚物聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇 （PVA）、聚N 乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸（PAA）等； C、生物大分子常用的有肝素、血浆蛋白、聚氨基酸类等；蛋白质或其他大分子物质等,大分子多聚物与具有生物活性的大分子物质通过共价键将大分子连接到酶分子表面，使之在酶的表面形成覆盖层，从而使酶的性质产生改变。 大分子在使用前要进行活化，方法有：溴化氢法、高碘酸氧化法、叠氮法、三氯均三嗪法等,O,白蛋白与酶之间以羰二亚胺作为交联剂的修饰反应,（修饰酶）,分子量在500-20 000 聚乙二醇

31、类修饰剂应用最广，其生物相容性通过FDA认证。其分子末端有两个能被活化的羟基。分子修饰时多采用单甲氧基聚乙二醇（MPEG）,MPEG均三嗪衍生物 MPEG琥珀酰亚胺类衍生物 MPEG氨基酸类衍生物,肝素含硫酸酯的粘多糖及适用于用来修饰溶解血栓酶类，增加酶的疗效。,酶经修饰后会产生各种各样的变化，概括起来有： (1) 热稳定性提高 修饰剂共价连接于酶分子使其天然构象产生一定的“刚性”，并形成分子内部基团的热振动，增加稳定性； 修饰剂本身增加了酶分子表面的亲水性。 (2) 抗各类失活因子的能力提高 修饰剂所产生的空间屏蔽有效的阻挡了各类失活因子； 酶分子中对蛋白质水解酶失活因子敏感基团被修饰。 (

32、3) 抗原性消除； (4) 体内半衰期延长； (5) 最适pH改变； (6) 酶学性质变化； (7) 对组织分布能力改变,2、修饰酶的特性,3、化学修饰的局限性,(1)某种修饰剂对某一氨基酸的化学修饰专一性是相对的。 (2)化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变，因此这种构象变化将妨碍对修饰结果的解释。 (3)只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，对于维持酶的空间构象的其它氨基酸侧链，目前还不能用化学修饰方法研究这些氨基酸残基酶的结构与功能中的作用。 (4)酶的化学修饰所提供的信息还得用X射线和其他方法来确定。,4、酶化学修饰的应用,1、固定化酶的特点: 对温度机械强度的稳定性高；可以反复使用

33、 更适合多酶体系 2、酶的固定化方法: （1）载体结合法:将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法。根据结合的方式不同，又可分为物理吸附、离子结合和共价结合三种。 *物理吸附：借助非共价键把酶吸附到载体上，如活性碳。 *离子结合：通过离子键结合于具有离子交换基团的水不溶性载体的固定化方法。载体为阴阳离子交换剂、树脂等。 特点：易制备利用效率高，但酶易流失。 *共价结合法：通过共价键把与酶活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水的载体上。 特点：结合牢固，但得率低。,(二)固定化酶 (immobilized enzyme),（2） 包埋法 网格型：将酶包埋于高分子化合物形成的网格中 微囊型：将酶包埋

34、在半透膜中 缺点：孔径大小影响底物或 产物进出 （3）交联法 通过双功能试剂或多功能试剂（如戊二醛等）将酶蛋白与酶蛋白中的氨基酸残基作用，使酶与酶之间交联成网，凝集成固定化酶. 常用的是戊二醛彼此交联,固定化酶法生产高果糖浆,也称果葡糖浆或异构糖浆，它是以酶法糖化淀粉所得的糖化液，经葡萄糖异构酶的异构作用，将其中一部分葡萄糖异构成果糖，由葡萄糖和果糖而组成的一种混合糖糖浆。,淀粉 液化、糖化 葡萄糖浆 膜过滤 浓缩 异构化 部分变成果糖（42%）混合 浓缩、精制 55%高果糖浆 参与的酶：-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡萄糖异构酶,高果糖浆的生产流程,固定化葡萄糖异构酶 葡萄糖 果糖 42%高果糖玉米糖浆：215万吨/年 55%高果糖玉米糖浆：145万吨/年,（三）人工酶（synzyme),人工酶又称模拟酶或酶模型，吸收酶中起主导作用的因素，利用有机化学或生物化学等方法设计和合成的一些较天然酶简单的具有催化能力的蛋白或非蛋白分子。 人工酶是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征，以及酶的作用机理和立体化学等特性的技术。 必须具备两个结构要素：一是底物结合位点；另一是催化位点。,难度大，产品活性低，发展缓慢。,（四）催化性抗体 (abzyme)： 也称抗体酶，是一种具有催化功能的抗体分子。其抗原结合部位被赋予了催