实验基础知识细胞因子

1、实验基础知识细胞因子、TNF-肿瘤坏死因子( Tumor Necrosis Factor ， TNF) 可分为TNF a和TNFB两种，前者来自单核巨噬 细胞，后者由活化T细胞产生，是具有重要生物 活性的细胞因子。存在于细胞上的 TNF 受体主 要有两种：TNFRI和TNFRI，血清中存在的是 可溶性的TNFR(s TNFRI , s TNFR I),它们的 相互作用不仅对多种肿瘤细胞有细胞毒作用， 还 与炎症和发热反应、 关节炎、 败血症及多发性硬 化等疾病有密切关系。1.TNF的产生(1) TNF-a是一种单核因子，主要由单核细胞 和巨噬细胞产生，LPS是较强的刺激剂。IFN-丫、 M-C

2、SF GM-CSF对单核细胞/巨噬细胞产生 TNF- a有刺激作用，而PGE则有抑制作用。前单核细 胞系U937、前髓细胞系HL-60在PMA刺激下可 产生较高水平的TNF-a。T淋巴细胞、T细胞杂 交瘤、T淋巴样细胞系以NK细胞等在PMA刺激 下也可分泌 TNF-a。SAC PMA抗IgM可刺激 正常B细胞产生TNF-a。此外，中性粒细胞、 LAK星状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞亦可产 生 TNF-a。(2) TNF-3是一种淋巴因子，抗原和丝裂原均 可刺激 T淋巴细胞分泌 TNF-3。PMA刺激 RPMI仃88B淋巴母细胞可分泌高水平TNF-B。3. TNF的受体(1) TNF-R的分型：T

3、NF-R可分为两型：1型 TNF-R， 55kDa， CD120a， 439氨基酸残基，此型 受体可能在溶细胞活性上起主要作用；型 TNF-R， 75kDa CD120b， 426 氨基酸残基，此型 受体可能与信号传递和 T 细胞增殖有关。两型 TNF-R均包括胞膜外区、穿膜区和胞浆区三个部 分，胞膜外区有 28%的同源，但在有包浆区无同 源性，可能与介导不同的信号转导途径有关。 TNF-R属于神经生长因子受体(NGFR超家族。 TNF-a和TNF-3的受体可能是同一的。TNF-R存 在于多种正常及肿瘤细胞表面， 一般每个细胞受 体数目有103104,如ME-180肿瘤细胞系TNF- a R约

4、2000/个细胞，Kd为2*10-10M。不同细胞 表面TNF-a R的数目和亲和力似乎与细胞对 TNF-a的敏感性并不平行。TNF-a与相应受体结 合后信号传递的机理尚不清楚， 可能与活化蛋白 激酶 C (PKC) ，催化受体蛋白磷酸化有关。(2) 可溶性TNFR TNF结合蛋白(TNF-BP是TNFF的可溶性形式，有 sTNf RI( TNF-BPI)和 sTNFRI( TNF-BRI)两种。一般认为 sTNFR具 有局限TNF活性，或稳定TNF的作用，在细胞因 子网络中有重要的调节作用。 Seckiner 1988 年 发现发热患者尿中有 TNF 抑制物，分子量为 33kDa。 Olss

5、on 1989 年在慢性肾功不全患者血 和尿中也发现有TNF-BP TNF-BP可与TNF特异 结合，抑制TNF活性，如抑制其细胞毒活性和诱 导IL-1产生，可促进皮下接种 Meth A肉毒的生 长，可见于正常妊娠尿中。炎症、内毒素血症、 脑膜炎双球菌感染、 SLE、HIV 感染、肾功不全 时以及肿瘤时可升高。可溶性 TNFR可有效地减轻佐剂性关节炎的病理改变以及败血症休克。4. TNF的生物学活性TNF-a与TNF-3的生物学作用极为相似，这可 能与分子结构的相似性和受体的同一性有关。 但 有某些生物学作用方面也有不同之处。(1)杀伤或抑制肿瘤细胞：TNF在体内、体外 均能杀死某些肿瘤细胞(

6、 cytolytic action) ， 或抑制增殖作用( cytostatic action )。肿瘤细 胞株对TNF-a敏感性有很大的差异，TNF-a对 极少数肿瘤细胞甚至有刺激作用。 用放线菌素 D、 丝裂霉素C放线菌酮等处理肿瘤细胞(如小鼠 成纤维细胞株L929)可明显增强TNF-a杀伤肿 瘤细胞活性。体内肿瘤对 TNF-a的反应也有很 大的差异，与其体外细胞株对 TNF-a的敏感性 并不平行。同一细胞系可能有敏感株和抵抗株如 L929-S和L929-R。此外，靶细胞内源性 TNF的 表达可能会使细胞抵抗外源性 TNF 的细胞毒作 用，因此，通过诱导或抑制内源性TNF的表达可 改变细胞

7、对外源性TNF的敏感性。巨噬细胞膜结 合型TNF可能参与对靶细胞的杀伤作用。TNF杀伤肿瘤的机理还不十分清楚，与补体或穿 孔素( perforin) 杀伤细胞相比， TNF 杀伤细胞 没有穿孔现象， 而且杀伤过程相对比较缓慢。 TNF 杀伤肿瘤组织细胞可能与以下机理有关。 直接杀伤或抑制作用：TNF与相应受体结合后 向细胞内移， 被靶细胞溶酶体摄取导致溶酶体稳 定性降低，各种酶外泄，引起细胞溶解。也有认为TNFN激活磷脂酶A2,释放超氧化物而引起DNA 断裂，磷脂酶A2抑制剂可降低TNF的抗病效应。 TNF可或改变靶细胞糖代谢，使细胞内 pH降低， 导致细胞死亡。 通过TNF对机体免疫功能的调

8、节作用，促进 T 细胞及其它杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤。 TNF作用于血管内皮细胞，损伤内皮细胞或导 致血管功能紊乱， 使血管损伤和血栓形成， 造成 肿瘤组织的局部血流阻断而发生出血、缺氧坏 死。（2）提高中性粒细胞的吞噬能力，增加过氧化 物阴离子产生，增强 ADCC功能，刺激细胞脱颗 粒和分泌髓过氧化物酶。TNF预先与内皮细胞培 养可使其增加 MHQ类抗原、ICAM-1的表达，IL-1、GM-CSI和IL-8的分泌，并促进中性粒细 胞粘附到内皮细胞上， 从而刺激机体局部炎症反 应，TNF-a的这种诱导作用要比 TNF-3为强。TNF刺激单核细胞和巨噬细胞分泌IL-1，并调节 NHQ类抗原的表达

9、。（ 3）抗感染：如抑制疟原虫生长，抑制病毒复 制（如腺病毒型、疱疹病毒U型），抑制病毒 蛋白合成、 病毒颗粒的产生和感染性， 并可杀伤 病毒感染细胞。TNF抗病毒机理不十分清楚。（4）TNF 是一种内源性热原质，引起发热，并 诱导肝细胞急性期蛋白的合成。TNF引起发热可 能是通过直接刺激下丘脑体温调节中枢和刺激 巨噬细胞释放 IL-1 而引起，还可通过 IL-1 、TNF- a刺激其它细胞产生IL-6。(5) 促进髓样白血病细胞向巨噬细胞分化，如 促进髓样白血病细胞 ML-1、单核细胞白血病细 胞U937早幼粒白血病细胞HL60的分化，机理 不清楚。TGF-B可抑制TNF-a多种生物学活性，

10、 但不抑制TNF-a对髓样白血病细胞分化的诱导 作用，甚至还有协同效应。(6) 促进细胞增殖和分化：TNF促进T细胞NHC I类抗原表达，增强IL-2依赖的胸腺细胞、T 细胞增殖能力，促进IL-2、CSF和IFN- y等淋 巴因子产生，增强有丝分裂原或外来抗原刺激 B 细胞的增殖和Ig分泌。TNF-a对某些肿瘤细胞 具有生长因子样作用，并协同EGF PDG!和胰岛 素的促增殖作用，促进EG隈体表达。TNF也可 促进c-myc和c-fos等与细胞增殖密切相关原癌 基因的表达，引起细胞周期由Go期向G1期转变。 最近报道INF- B( LT)是EB病毒转化淋巴母细 胞的自分泌生长因子，抗LT抗体、

11、sTNf R以及 TNF-a能抑制EB病毒转化淋巴细胞的增殖。IL-1、IFN- 丫和GM-CSI对TNF的生物学作用有 明显的增强作用，可能与增加细胞TNF受体的表 达有关。已报道一种抗 TNF-a单克隆抗体，可模拟TNF-a的某些生物学作用，这种现象在其 它因子中还尚未见到。IFN- y973 年 Younger 和 Salvin 发现来自淋巴细胞培 养上清中存在一种IFN，但抗原性不同于发现的 IFN，遂命名U型IFN, 1980年统一命名为y干 扰素。诱导吲哚胺 2， 3-双加氧酶的合成。1IFN- 丫可，后者参与色氨酸分解代谢，使色氨 酸转变为犬尿氨酸，使血液中色氨酸的水平下 降，可

12、能与出现神经系统症状有关。IFN- 丫诱导巨噬细胞可诱导性一氧化氮合酶(iNOS产生，促进NO的合成，IFN- y还可诱 导小胶质细胞星形细胞的iNOS产生，可能与中 枢神经系统的某些疾病的发生或保护作用有关。 IFN 在完全没有内毒素时不能刺激 IL-1 转录， 反而在转录水平抑制 IL-1 自身诱导的 IL-1 产 生，但IFN- y可增加LPS诱导的IL-1转录翻译 和分泌。bcl-2B 淋巴 细 胞瘤 -2 基 因简 称 bcl-2 ( B-cell lymphoma-2) , 是细胞凋亡研究中最受重视的癌 基因之一。自从 1972 年 Kerr 提出细胞凋亡 （ apoptosis

13、）的概念至今，人们对细胞凋亡现 象进行了广泛、深入的研究。但是，凋亡的分子 和生化机制迄今尚未彻底明了， 而已形成的初步 认识大多源于对 Bcl-2 基因家族的研究。已知， 凋亡进程可分为三个时相： 诱导期， 效应期和降 解期。在诱导期，细胞接受各种信号从而引发各 种不同的效应； 进入效应期后， 经过一些决定细 胞命运（存活 / 死亡）的分子调控点，细胞进入 不可逆的程序化死亡， 这些调控分子包括一系列 原癌基因和抑制癌基因的产生， 其中 Bcl-2 家族 起着决定性的作用； 降解期则产生可见的凋亡现 象。Bcl-2基因（即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因） 是一种原癌基因， 它具有抑制凋亡的作用

14、， 并且 近年来的一些研究已开始揭示这一作用的机制。 目前已经发现的 Bcl-2 蛋白家族按功能可分为 两类，一类是像 Bcl-2 一样具有抑制凋亡作用， 如哺乳动物的 Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、A1、线 虫Ced-9、牛痘病毒E1B119kD等，而另一类具 有促进凋亡作用，如 Bax、 Bcl-Xs 、 Bax、 Bak、 Bik/Nbk 、 Bid 和 Harakiri 。最初在血液淋巴细胞中发现 Bcl-2 能抑制细胞 死亡，随后陆续在其它一些细胞中也发现 Bcl-2 的这种作用。 但近年来研究发现， 除这些之外尚 存在 Bcl-2 不敏感的凋亡途径。敏感凋亡Bcl-2 可以

15、抑制由多种细胞毒因素所引起的细胞 死亡。 Bcl-2 的过度表达能增强所观察细胞对大 多数细胞毒素的抵抗性。 这一发现使人们认识到 凋亡的各种信号转导途径有一个共同的通路或 交汇点， 而该通路或交汇点受 Bcl-2 调节。实验 表明，Bcl-2可增强细胞对大多数DNA损伤因子 的抵抗性，抑制大多数化疗药物所引起的靶细胞 凋亡，但其本身并不能抑制这些因素对细胞的损 伤；同样地，它也不能促进 DNA修复。p53蛋白 是DNA损伤的一个分子传感器，已证实Bcl-2能 抑制 p53 介导的凋亡， 但不能抑制 p53 向核内转 位或者 p53 介导的生长停滞， 可能 Bcl-2 的作用 是在DNA损伤后

16、，阻止激活凋亡机制的信号到达 其靶分子；在细胞毒性T细胞中，由颗粒酶B激 活Caspases家族的一个或多个半胱氨酸蛋白酶 所诱导的凋亡不依赖于Bcl-2，颗粒酶B可能仅 作用于凋亡路径中 Bcl-2 调节位点的下游。 以上 结果表明在凋亡途径中 Bcl-2 的作用位点是在 信号分子和效应蛋白酶之间的位置。Bcl-2 抑制细胞凋亡可能与其以下几种作用有 关： 细胞催抗氧化作用以往研究表明，在去除生 长因子所诱发的凋亡中，活性氧损伤(ROS是 促发细胞死亡的主要诱因： Bcl-2 的过度表达可 减少氧自由基的产生和脂质过氧化物的形成。 提 示 Cai 等4 的实验表明 Bcl-2 的抗氧化作用是

17、 间接的，即可能在于抑制超氧阴离子的产生而不 是直接清除活性氧。 细胞色素 c( cytochrome c, Cyt c )作为呼吸链中重要的电子传递体，它从 线粒体内膜上的释放会阻断电子向下游传递体 危及呼吸链的功能并导致超氧阴离子的加速产 生；而 Bcl-2 可以抑制 Cyt c 的释放，从而抑制 了超氧阴离子的产生。此外， Bcl-2 还可以增加 胞内的谷胱甘肽(GSH等抗氧化剂，升高 NAD/NADH勺比值，抑制和凋亡相联系的GSH降低，促进GSH进入核内，从而影响细胞的氧化还 原状态。但也有证据表明， 在没有自由基的情况 下 Bcl-2 也能抑制凋亡。因此， Bcl-2 的性质远 非

18、仅仅是一种抗氧化剂。 抑制钙离子跨膜流动 Lam 等曾报道钙泵特异 性抑制剂 Thapsigargen （TG 诱导的 WEH17.2 等细胞的凋亡可被 Bcl-2 所抑制，其原因是 Bcl-2抑制了 Ca2啲跨膜流动，提 示Bcl-2可 通过调节胞内钙离子浓度来调节凋亡。然而 Wei 等在神经元细胞 GT1-7 中发现 Bcl-2 中发现 Bcl-2可抑制由TG所诱导的凋亡，但并不能抑 制TG诱导的胞内钙离子浓度升高；同时Jason等在中国仓鼠卵巢细胞5AHSmy（中去除细胞 内贮存Ca2+后发现过度表达的Bcl-2仍可抑制 凋亡，提示Bcl-2对胞内Ca2+浓度的调节作用 也只能是其抑制凋

19、亡的机制之一。 离子通道蛋白和吸附 / 锚定蛋白最近 Reed7 提出 Bcl-2 蛋白可能具有双重功能： 离子通道蛋 白和吸附 / 锚定蛋白，提出 Bcl-2 抑制凋亡的部 分新机制。 -1 离子通道蛋白 体外实验证实， Bcl-2 、 Bcl-X1 和 Bax 能在线粒体上形成离子通道，提 示它们可能参与调节一些与凋亡有关的细胞现 象，如线粒体通透性改变（巨孔形成）和线粒体 释放凋亡蛋白本科激活因子 Cyt c 和凋亡诱 导因子（AIF）。过度表达的Bcl-2能抑制线粒体 通透性改变，并影响巨孔的形成， 从而抑制凋亡。 但也有实验发现即使线粒体通透性未改变， Cyt c 等凋亡激蛋白也可以

20、释放到胞液中从而诱发细 胞凋亡，因此这种观点还有待进一步证实。 在所观察的细胞系及多种情况下， 凋亡的发生都 伴有 Cyt c 从线粒体释放，继而伴有 Caspases 激活，而活化的 Caspases 降解底物后，其蛋白 降解产物又引起线粒体通透性改变， 并最终导致 凋亡发生。 Yang 等与 Kluck 等发现 Bcl-2 可以 通过抑制线粒体释放 Cyt c 来抑制凋亡，继而 Rosse 等和 Zhivotovsky 等用两种不同的方法证 明了即使 Cyt c 已经释放入胞浆， Bcl-2 仍能延 迟细胞死亡，这是由于 Bcl-2 抑制了活化的 Caspases 对 线 粒 体 释 放

21、的 上 游 和 下 游 都 有 Bcl-2 调节凋亡的作用点。AIF 作为一种线粒体来源的效应蛋白酶，在分离 在胞核中能诱导凋亡， 同时还能激发线粒体通透 性改变，诱导线粒体释放 Cyt c 和 Caspase-9， 并在体外切割和激活其底物半胱氨酸蛋白 酶CPP32体外研究发现，Bcl-2过度表达可能 阻止 AIF 从分离的线粒体上释放， 但它并能影响 AIF 的产生，同时也不能影响 AIF 促凋亡的功能。-2 吸附/ 锚定蛋白 在正常情况下 Bcl-2 通过 其 C 端疏水残基的伸展而锚定在细胞内膜上， 作 为吸附 / 锚定蛋白，可把胞液蛋白固定在膜边， 或是引导胞液蛋白与别的膜蛋白相互作

22、用。Bcl-2 可与 Bcl-2 家族的 Bcl-X1 、Bcl-Xs 、Bax、 Bcl-2 、Bad 和 Mc1-1 形成同源的蛋白二聚体， 而特定的蛋白二聚体则可作为在细胞死亡信号 通路上的分子开关。例如，Bcl-2可与促凋亡Bax 形成二聚体，如果Bax相对量高于Bcl-2，则Bax 同二聚体的数量增多， 从而促进细胞死亡； 而如 果Bcl-2相对量高于Bax,则促进形成Bcl-2/Bax 异二聚体， 并使 Bcl-2 同二聚体的量增多， 从而 抑制细胞死亡；而促凋亡分子和 Bad 和 Bcl-Ss 则竞争结合细胞死亡抑制分子如 Bcl-X1 或 Bcl-2，由此替换了 Bax并促进B

23、ax同二聚体形 成，诱导凋亡。另外， Bcl-2 还可与 Bcl-2 家族外的 11 种蛋白 质结合，包括蛋白激酶 Raf-1 、蛋白磷酸酶 Calcineurin、GTP酶、R-Ras 和 H-Ras、p53-BP2、 朊蛋白 Pr-1 、 Ced-4、 BAG-1、 Nip-1 、 Nip-2 和 Nip-3 ，并由此实现其抗凋亡作用。不敏感Bcl-2 抑制凋亡的作用并不是万能的，例如在细 胞毒T细胞杀伤作用中，特定的淋巴因子撤离以 及某些TNF受体家族介导的凋亡途径中Bcl-2不 能抑制凋亡， 其原因右能是这些凋亡诱导剂作用 于 Bcl-2 下游或是独立于 Bcl-2 的其它凋亡路 径。

24、最近Scaffidi等发现，Jurkat等细胞（U 型细胞）中Bcl-2可抑制TNF受体家族中的CD95 （ Apo-1/ F as ）信号通路介导的凋亡， 而在 SKW6.4 等细胞（I型细胞）中Bcl-2则不能抑制这种信 号通路介导的凋亡。其结果表明，凋亡途径对 Bcl-2 敏感与否可能与细胞类型有关。进一步研 究发现，这种差异取决于线粒体是否参与这种凋 亡途径，在I型 细胞中线粒体则未参与该凋亡 途径。因此， Bcl-2 可能只抑制依赖于线粒体的 凋亡途径。更进一步研究发现， 来源于牛痘病毒的细胞因子 应答修饰体A （crmA）是一种丝氨酸蛋白酶抑制 剂（ serpin ）类分子，能抑制

25、一些 Caspases 的 功能。而来源于杆状病毒的P35蛋白也能抑制一 些Caspases的功能，而且它比CrmA具有更广泛 的 Caspases 抑制特性。在组织培养体系中或转 基因鼠的T淋巴细胞中CrmA表达能抑制CD95(Fas/Apo-1 )和p55TNF受体I诱发的凋亡，但 对另一些诸如生长因子撤除，DNA损伤等细胞毒 因素引起的凋亡则无能为力， 而这些由细胞毒因 素引起的凋亡现象则可被 Bcl-2 及其同系物所 抑 制 ， 但 是 Bcl-2 又 不 能 抑 制 由 CD95(Fas/Apo-1 )和TNF受体介导的凋亡。由细胞 毒因素及 TNF 受体家族介导的凋亡都可有效地 被

26、 p35 所抑制，提示这些通路都依赖于 Caspases 的激活。 上述结果表明， 在细胞中不同的凋亡激 活途径同时存在，其一是需要对 CrmA 敏感的 Caspases 参与但又不能被 Bcl-2 所抑制；而另 一 个 则 是 Bcl-2 可 抑 制 的 凋 亡 途 径 ， 其 中 Caspases对p35敏感，但对 CrmA则不敏感。 总结 目前 Bcl-2 是凋亡分子机制研究的主要靶分子。 随着对 Bcl-2 以及凋亡本身研究的日渐深入， Bcl-2 的作用机制和凋亡的分子机制最终被阐 明，从而提高对与凋亡有关的疾病的认识和诊治 水平。B-cell CLL/lymphoma 2 在哺乳动

27、物细胞中， 调节线粒体外膜通透性， 大 多数定位在线粒体外膜上， 或受到信号刺激后转移到线粒体外膜上。根据其功能可分为两组：Bcl-2, Bcl-xl, Bcl-w 等 抑 制 细 胞 凋 亡 ； Bax,Bak,Noxa 等促进细胞凋亡。关于 Bcl-2 家族调控线粒体外膜通透性的机制， 假说之一是，细胞接受凋亡信号后促凋亡因子Bax和Bak发生寡聚化，从细胞质中转移到线粒 体外膜上，并与膜上的电压依赖阴离子通道相互 作用，使通道开放到足以使线粒体内的凋亡因子 如细胞色素 c 等释放到细胞质基质中， 引起细胞 死亡。GAPDHGAPDH或 G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceral

28、dehyde-3-phosphatedehydrogenase )的英文缩写。 该酶是糖酵解反 应中的一个酶，由4个30 - 40kDa的亚基组成， 分子量 146kDa。该酶是糖酵解反应中的一个酶，由 4 个 30 40kDa的亚基组成，分子量146kDa。该酶基因为 管家( house keeping )基因，几乎在所有组织 中都高水平表达， 在同种细胞或者组织中的蛋白 质表达量一般是恒定的， 且不受含有的部分识别 位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定， 故被广泛用作抽提 total RNA ，poly（A）+ RNA ， Western blot 等实验操作的标准化的内参。常 用的内

29、参有，ACTB（3 -actin、B -肌动蛋白）、 GAPD或18S等。目的是在于避免RNA定量误差、 加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均 一、各孔间的温差等所造成的误差、 这些都是管 家基因， 在各个组织中的表达量相对稳定， 其中 18S同整个基因谱有关（负责装配），它在总RNA 中占的比例最高。GAPD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的 一种关键酶，由 4 个 30-40kDa 的亚基组成，分 子量146kDa,检测条带大约在36kD& GAPDH基 因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作 Western blot蛋白质标准化的内参。因为 GAPDH 作为管家基因在同种细

30、胞或者组织中的蛋白质 表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参抗 体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品 的GAPD含量相除，得到每个样品目的蛋白的相 对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。GAPDH的分子量约为37kd.MHC主要组织相容性复合体 (majorhistocompatibilitycomplex , MHC)MHC 是由一群紧密连锁的基因群组成，定位于动物或 人某对染色体的特定区域，呈高度多态性。其编 码的分子表达于不同细胞表面，参与抗原递呈， 制约细胞间相互识别及诱导免疫应答。不同种类 哺乳动物MH(及其编码产物的名称各异。小鼠的 MH(称为H-2复合体。人类的MH

31、C!常称为HLA 基因或HLA复合体。其编码的分子表达于白细胞 上，称为人类白细胞抗原 (humanleucocyteantigen ， HLA)。人类的 MHC因 为要和基因区分，所以常称为HLA分子或HLA抗 原。基本类型MHC又称主要组织相容性复合基因，是存在于大部分 脊椎动物基因组中的一个基因家族，与免疫系统 密切相关。共分成三类：第一型： MHC class I(MHC I)位于一般细胞表面上，可以提供一般 细胞内的一些状况，比如该细胞遭受病毒感染， 则相病毒外膜碎片之氨基酸链（ peptide ）透过 MH（提示在细胞外侧，可以供杀手T细胞等辨识， 以进行扑杀。第二型：MHlass

32、 n（ MHCn ）只位于抗原提 呈细胞（APC上，如巨噬细胞等。这类提供则是 细胞外部的情况， 像是组织中有细菌侵入， 则巨 噬细胞进行吞食后，把细菌碎片利用mhC提示给 辅助 T 细胞，启动免疫反应。第三型：MHC class皿（MHC皿）主要编码补 体成分，肿瘤坏死因子（TNF）,热休克蛋白70（HSP70和 21 羟化酶基因（CYP21A和 CYP21B） 研究简介主要组织相容性复合体（MHC系编码主要组织 相性抗原的基因群， 是早期从组织器官移植实验 中发现的， 也是当今免疫遗传学的主要内容。 已 发现，在人群或同种动物不同个体间进行皮肤移 植时出现的排斥反应， 具有记忆性、 特异性

33、和可 转移性等免疫反应的基本特征，故从廿世纪 40 年代起就确认移植排斥反应是一种典型的免疫 现 象 。 引 起 排 斥 反 应 的 抗 原 称 移 植 抗 原 （ transplantation antigen）或组织相容性抗原( histocompatibility antigen)。此等抗原存在于细胞表面， 无器官特异性， 不同个体间其 抗原特异性互不相同， 但同卵双生及纯系动物不 同个体之间，其抗原特异性完全一致。 组织相容性抗原包括多种复杂的抗原系统。 凡能 引起快而强的排斥反应者称为主要组织相容性 抗原系统，引起慢而弱的排斥反应者称为次要组 织相容性抗原系统。 若供者、 受者双方的

34、多个次 要组织相容性抗原不匹配， 同样会迅速发生明显 的排斥反应。现已证明，MH(不仅控制着同种移 植排斥反应， 更重要的是与机体免疫应答、 免疫 调节及某些病理状态的产生均密切相关。因此， MHC勺完整概念是指脊椎动物某一染色体上编码 主要组织相容性抗原、 控制细胞间相互识别、 调 节免疫应答的一组紧密连锁基因群。关于MHC勺发现、基因组成和功能的了解，多基 于小鼠实验。因此，从廿世纪 30 年代起已确定 小鼠的MHC位于第17号染色体上，称为H2复合 体。H2复合体由K区、I区、S区和D区组成， 其中 I 区又分为 IA 和 IE 两个亚区，其基因编码 产 物 称 为 I 区 相 关 抗

35、原 (Iregionassociatedantigen;IaantigenI )。1958年 Dausset 等发现，多次接受输血的患者、 多产妇和用同种白细胞免疫的志愿者血清中， 存 在不同特异性的白细胞抗体， 用这些抗体鉴定出 许多不同特异性的白细胞抗原， 称为人类白细胞 抗原(human leucocyte antigen, HLA)。 通过家系和人群遗传分析发现，人类MH(位于第6号 染色体上， 称为 HLA 复合体。 各种脊椎动物都有 自己的MHC除了人的HLA和小鼠的H2外，恒 河猴、黑猩猩、狗、兔、豚鼠、大鼠和鸡的 MHC 分别称为 RhLA ChLA DLA RLA GpLA

36、AgBI (H-1 I )和B。本章主要介绍人类 HLA复合体 及其编码产物的结构、分布和功能，及HLA抗原 检测在医学上的意义等内容。MHC吉构特点 多基因性 多基因性：基因复合体由多个紧密相邻的基因座 位组成，其编码产物具有相同或相似的功能。例如：小鼠H-2: 17号染色体：6号染色体短臂 (6P21.31),全长 3600-4000kb , 224 个基因座 位( 128个功能基因， 96 个假基因)。多态性多态性：群体中在同一个HLA基因座位上存在两个或两个以上等位基因。HLA的遗传特点：高度多态性；单体型遗传；连 锁不平衡。1）复等位基因 位于一对同源染色体上对应位置的一对基因称 为

37、等位基因（ allele ）；由于群体中的突变，同 一座的基因系列称为复等位基因。HLA复合体的 每一座存在为数众多的复等位基因， 由于各个座 位基因是随机组合的， 故人群中的基因型可达千 万之多。复等位基因和共显性导致了 HLA的多态性。2）共显性表达 一对等位基因同为显性称为共显性。 在杂合子状 态下，等位基因均表达出相应产物。共显性大大增加了人群中HLA表型的多样性。MHC多态性的意义：1 . 扩大种群对抗原肽的提呈范围，有利于维持 种群的生存与延续。（HLA产物的多态性主要表现在抗原结合槽的氨 基酸残基在组成和序列上不同）2 . 不利于器官移植中供体的选择。MHC勺生理意义MH（抗原最

38、初是作为移植抗原而被发现的，是引 起移植排斥的主要抗原系统。 这种抗原不合， 即 可引起受体的免疫应答，排斥移植的供体组织。 70年代后证明MHC分子还具有重要的免疫生理 功能。MH（分子在免疫应答过程中参与抗原识别。70年 代R.M.津克纳泽尔等在小鼠实验中发现杀伤 T 细胞在杀伤感染病毒的靶细胞时， 只能杀伤同系 感染靶细胞， 而对不同系的感染靶细胞则无杀伤 作用，称这种现象为遗传限制性。 随后证明杀伤 T细胞与靶细胞的MH（必需一致才有杀伤作用， 因此又称此现象为MHC限制性。这揭示了 MH（在 T细胞识别异种抗原中的作用。进一步的研究证 明T4的T细胞在识别异种抗原时受 MHCH类分

39、子限制，而 T8 的 T 细胞识别异种抗原时受 MHC I类分子限制。这种限制性的机制是：T细胞通 过其抗原识别受体， 可同时识别异种抗原决定簇 和自己MH（分子形成的新的复合抗原决定簇。 人们还发现外周血B细胞和单核细胞等非T细胞 在体外能诱导某些自身反应性 T 细胞发生增殖 反应，称这种现象为自身混合淋巴细胞反应 （AMLR）,并证明这是由非T细胞上MH类抗原 引起的。这种自身反应性 T 细胞在体内可能具有 增强或抑制免疫功能的作用， 借以维持机体的免 疫稳定性，因此MH（分子也参予免疫调节作用。 研究证明，MH（分子对T细胞在胸腺内的分化成 熟过程也起重要作用。体外研究发现 : 去除胸腺

40、 中MHCI类抗原阳性的基质细胞，贝U T4T细胞的 发育受阻，在胸腺培养细胞中加入抗 MH类抗 原的单克隆抗体，也能阻止T4T细胞的发育。目 前认为MH（分子在T细胞自身耐受的形成和T细 胞库的产生中都起着重要作用。HLA研究HLA复合体位于第6号染色体短臂上大约4000kb 范围内，由一群密切连锁的基因组成。HLA复合体是迄今已知的人体最复杂的基因体系。 从着丝 点一侧起依次为口类基因、川类基因和I类基因 区域所在。I类基因区包括HLA?A B、C位点的等位基因， 编码HLA?A抗原、B抗原和C抗原等经典的I类 抗原（分子）。近年来相继发现大量与I类基因 结构相似的基因，已被正式命名的有

41、HLA-E、 F、 G H J、K、L。其中HLA-E F、G基因可编码 非多态性的I类样抗原（或非经典I类抗原），但它们的确切功能尚未清楚。HLA-H、J、K、 L则属于假基因。H类基因区十分复杂，主要包括 HLA-DR DQ DR三个亚区和新近确定的 DN DO DM等3个亚区。该区的基因是以它们所编码的 肽链(a、3)直接命名，女口 DRA DRB 1 DRB2 等。已知该区至少存在 7个编码a链和16个编 码3链的基因， 其中有的基因有表达功能， 有的 功能不明，有的属于假基因。现在证明，在U类基因区内存在与内源性抗原处 理和递呈相关的基因，即 LMR和TAR LMP又称 蛋白酶体相关基因(proteasome?related gene),由LMP2和LMP7两个基因组成，其编码 产物 LMP(low molecular mass polypeptide or large multifunctional protease )与内源性抗 原的处理有关。 TAP 为多肽转运体基因，包括 TAP1 和 TAP2 两 个 基 因 ， 其 编 码 产 物 TAP(transporter of antigenic peptides)与抗原肽的转运有关。HLA复合体I类和U类区基 因名称见表 5.1 。皿类基因区内已定位的至少有 36个基因，其中 与免疫系统有