FISH基本原理ppt课件

1、荧光原位杂交技术,原理 仪器耗材 试剂及配制 标本制备 探针的制备 杂交与检测 注意事项,1,一、原理,将荧光素直接标记的核酸探针（或生物素、地高辛等标记的核酸探针）与标本中的靶核酸序列按照碱基互补配对原则进行杂交，经洗涤后直接（或通过免疫荧光信号扩增）在荧光显微镜下观察，从而对靶目标中的待测核酸进行定性、定位或定量的研究。,2,二、仪器耗材,仪器： 荧光显微镜及分析软件， PCR扩增仪（变性），370C隔水培养箱(杂交)，湿盒，恒温水浴箱，冰箱，普通离心机，小型高速低温离心机，移液枪（1000ul,200ul, 20ul，10ul）,玻片盒，通风橱，震荡混匀器，染色缸、计时器，温度计，温湿度

2、显示器，量筒，酒精灯，烧杯，天平，试剂瓶等。,3,二、仪器耗材,耗材： 离心管(50ml,15ml,1.5ml)，PCR管，各种规格的tip头，载玻片（带磨砂的），大盖玻片（ 方形，用于镜检），小盖玻片（一般用圆形，用于杂交时候封片），封片胶等。,4,三、试剂,液体LB，氯霉素，STE，BAC试剂盒，异丙醇，NICK试剂盒，无水乙醇，甲酰胺, 20SSC，2SSC ，70%酒精，90%酒精，100%酒精，BSA，HumanCotI DNA，50%硫酸葡聚糖，0.3%NP40/0.4SSC， PBS缓冲液，0.1%NP40/2SSC，DAPI 染色液等。,5,四、标本制备,按第四章人淋巴细胞培养

3、及收获及染色体制备收获外周血中期染色体，调整悬液浓度（20倍物镜视野下20-30个细胞，分裂指数在4%以上为宜），悬液-200C保存。,6,五、探针的准备,BAC-DNA的抽提 标记 纯化,7,1、BAC-DNA的抽提,无菌操作台上，接种BAC菌种7ul于含氯霉素（氯霉素终浓度为30ug/ml）的15ml液体LB培养液中，空气摇床上37，280rpm，震荡培养18-20h。 4000 rpm，4，离心10min 去上清，加入5mlSTE(冰预冷)重悬 4000 rpm，4，离心10min 去上清，加入250ul P1 (冰预冷)重悬 转入1.5mlEP管中(冰预冷5min) 加入250ul P

4、2(预温)轻轻转6次，室温静置5min 加入250ul P3(冰预冷)轻轻转6次，冰上5min 13200 rpm，4，离心10min,8,1、BAC-DNA的抽提,移上清至新的EP管（冰预冷），加入700ul异丙醇，混匀 13200 rpm，4，离心10min 去上清，加入1ml 70%无水乙醇混匀 13200 rpm，4，离心10min 去上清，加入15ul Nuclease-free water溶解DNA 室温放置,9,2、标记探针,采用缺口平移标记法（NICK试剂盒） 在0.5mlEppendorf管中加入： Nuclease-free water 13.5ul dNTP mix （0

5、.1mM） 10ul dTTP（0.1mM） 5ul 10buffer 5ul 模板DNA（1-1.5ug） 6ul SpectrumGreen 或 SpectrumOrange 或 SpectrumRed dUTP（0.2mM） 2.5ul Nick translation enzyme 8ul 总体积 50ul,10,2、标记探针,上PCR仪： 15 8小时 75 10分钟灭活 4保存 取标记后的探针5ul跑1%琼脂糖凝胶电泳检测，标记后探针长度范围在100-400bp较好（稳定，达到5000bp）,11,3、纯化探针,在1.5mlEppendorf管中加入： Ecoli tRNA（1ug

6、/ul） 1ul 鲑鱼精DNA（10mg/ml） 5ul 8M醋酸胺 6ul 糖元 （10mg/ml） 1ul 4保存。,12,3、纯化探针,将标记好的探针加入上述Eppendorf管，再加入-20无水乙醇200ul，-70放置30分钟 4，15000rpm，离心10分钟 去上清，加入200ul70%乙醇 4，15000rpm，离心5分钟 吸去乙醇，立即加入甲酰胺25ul 室温，避光，溶解10分钟，-20保存,13,六、杂交与检测,外周血玻片准备 杂交体系准备 杂交 洗脱 结果观察,14,1、外周血玻片准备,75烤箱烘烤2小时 置于2SSC 中30min 依次放入70%，90%，100%酒精中

7、各2min 室温干燥,15,2、杂交体系准备,在1.5mlEppendorf管中加入 20SSC 1.5ul BSA（1ug/ul） 1ul HumanCotI DNA （1mg/ml） 2ul 探针 3.75ul 甲酰胺 3.75ul 50%硫酸葡聚糖 3ul 总体积 15ul,16,3、杂交,PCR扩增仪开启，使温度达到80 滴加配好的杂交液15ul于杂交区 盖上盖玻片，封胶，PCR扩增仪80变性2min 将玻片置于湿盒，放入37杂交16小时以上,17,4、洗脱,杂交次日 70 0.4SSC/0.3%NP40 漂洗2min 室温 2SSC/0.1%NP40 漂洗 1min 室温2SSC 2min 室温70%，90%，100%酒精中脱水各2min 室温干燥 加20ul DAPI加到杂交区，盖上盖玻片，复染10min 荧光显微镜下观察结果,18,5、结果观察,观察镜下荧光杂交信号， 计数30个细胞和采集4张图像。,19,七、注意事项,玻片准备时要注意玻片的干净和透明度； 杂交过程中要保持湿润； 杂交必须对玻片变性温度进行摸索； 染色体制备分裂相应尽量