动物细胞制药

1、第六章 动物细胞工程制药,一、动物细胞的形态 通常将离体培养的细胞分为贴壁细胞、悬浮细胞、兼性贴壁细胞。 1、贴壁细胞：细胞的生长必须有给以贴附的支持物表面，细 胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面生长、增殖。当细胞在该表面生长后，一般形成两种形态：成纤维样细胞型、上皮样细胞型。 2、悬浮细胞：细胞的生长不依赖于支持物表面，可在培养液中呈悬浮状态生长。如血液中的淋巴细胞。 3、兼性贴壁细胞：有些细胞的生长不严格地以来于支持物，它既可以贴附于支持物表面上生长，也可以在培养基中呈悬浮状态良好地生长,第一节 动物细胞的形态与生理特点,二、动物细胞细胞的生理特点 1、细胞的分裂周期长：

2、一般需要12-48h，随不同的种属不同而不同。 2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。细胞生长需要于基质上贴附，伸展后才能生长繁殖。 3、正常二倍体细胞的寿命是有限的。随着年龄增大而细胞的培养代数会减少。 4、对周围的环境十分敏感。 5、对培养基的要求高：需要12种必需氨基酸、8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、葡萄糖、多种细胞生长因子、贴壁因子等才能生长。 6、蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同,第二节 生产用动物细胞的获得 一、生产用动物细胞的获得 什么样的细胞才能允许用以生产人用的药品，这一直是一个引起人们争论的热点。 用于生产的动物细胞有：原代细胞、已建立的二倍体细胞系、可

3、无限期传代的转化细胞系、以及用这些细胞进行融合和重组的工程细胞。 1、原代细胞：直接取动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。 2、二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆，而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株,二倍体细胞株仍具有正常细胞的特点： A、2n染色体核型 B、具有明显的贴壁依赖和接触抑制 C、只有有限的增殖能力、一般可连续传代培养50代。 D、无致瘤性 3、转化细胞系：是通过某个转化过程形成的，常常由于染色体的断裂变成了异倍体，而失去了正常细胞的特点，获得了无限增殖的能力,二、基因工程细胞的构建和筛选 1、真核细胞基因表达载体的构建 目前一般选择的

4、载体有： （1）病毒载体：牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒和杆状病毒等。 牛痘病毒：构建多价疫苗； 腺病毒、反转录病毒：用于基因治疗； 杆状病毒：作载体用于外源基因表达。 杆状病毒作为载体的优点： 是双DNA，易于重组； 插入7-8个bp的DNA不会影响正常病毒粒子的形成； 多角体蛋白质和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子； 多角体蛋白基因有强启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20-30%； 用显微镜可以看到多角体，可以此为标记物来挑选阳性克隆； 如果用家蚕杆状病毒，可以在家蚕体内直接表达外源基因,2）质粒载体 常用穿梭质粒载体：能在细菌和哺乳

5、动物细胞内都能扩增,2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选,DNA导入动物细胞的常用方法,高效表达工程细胞株的筛选： 依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系统：HAT选择系统：筛选tk+、hgprt+的转化细胞；G418（geneticin）选择系统：筛选neor的转化细胞；MTX选择系统：筛选dhfr+的转化细胞。 对选出的细胞要进行克隆和亚克隆使其纯化 在多数情况下要利用其扩增系统，不断增加其基因拷贝数，从而获得能高效表达的稳定的工程细胞株,三、常用生产用动物细胞的特性（自学,四、细胞库的建立 除原代细胞外，其他的细胞株、细胞系，无论是二倍体细胞、转化细胞、融合细胞还是经重组的工程

6、细胞，一旦建立后都要建立细胞库加以保存。按照我国和美国FDA的规定，用于生产的工程细胞必须建立2个细胞库： （1）原始细胞库（master cell bank,MCB）； （2）生产用细胞库（manufacturers working cell bank ,MWCB）或叫工作细胞库（working cell bank ,WCB,贮藏细胞的档案资料： 细胞系历史：来源、动物的年龄、性别、细胞分离方法、所用培养材料（来源于人的还需该人的病史） 细胞的特性： 形态、生长特性增倍时间、分种批；种源的特性：核型、同功酶、细胞抗原、特异的标记染色体；用于生产用的重组细胞：载体构建的资料、基因拷贝数、表达产

7、物的性质、产量及其稳定性。 各种有害因子的检查结果：细菌、真菌、支原体、各种病毒，包括反转录病毒。 MWCB细胞还需确定其最高使用的传代数,一、动物细胞的培养条件 1、器材的清洗和消毒 （1）器材的清洗：用过的器材需要经过浸泡、刷洗、泡酸、冲洗4个步骤。用3%磷酸三钠日夜浸泡过夜。新玻璃器材必须先泡酸。 （2）器材的消毒灭菌：所有培养用的器材和液体必须进行严格的消毒灭菌处理，方法有：物理消毒-紫外线、干热、湿热、过滤；化学法-化学消毒剂和抗生素,第三节 动物细胞的培养条件和培养基,2、水质 由于动物细胞对微量的有毒元素、过多的金属离子、微生物的污染很敏感。所以细胞培养用的水必须经过特殊处理，才

8、能使用。方法有：蒸馏、离子交换、电渗析、反渗透、中空纤维过滤。 3、pH 最适pH7.27.4，常在培养基中加入缓冲系统：Na2HPO4/NaH2PO4，NaHCO3/CO2，Tricine-glycine等。 4、渗透压 理想渗透压为290-300mOsm/kg，一般用NaCl的增减来调节。每增加或减少1mg/ml，可使培养基的渗透压增加或减少32mOsm/kg。 5、温度 哺乳动物最佳温度为370.5，昆虫为27。 6、空气 必须给以足够的氧气，一般低于空气中氧的饱和值的60,二、动物细胞培养基的种类和组成 动物细胞对培养基的要求较高，且随着细胞的种属不同而差异很大。常常需要花很多的时间和

9、精力去对个别的细胞系进行研究，以便配置适宜于这一细胞特殊需要的培养基。用动物细胞制药之所以成本高，培养基的复杂和昂贵是其主要原因。培养基包括 1、天然培养基 指在细胞培养的早期使用，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。 2、合成培养基 采用成分明确的化学试剂配成的培养基。 优点：成分明确，组分稳定，可大量生产供应,合成培养基的组成： 氨基酸类：12种必须氨基酸。它们是：精氨酸、胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、奔丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。 维生素： A、脂溶性的：VA、VD、VE、VK。 B、水溶性的：VB族、VC等 糖类：C源，是能量来源。 葡萄糖

10、、谷氨酰胺。使用葡萄糖时，要加入丙酮酸钠；有些还要加入核糖和脱氧核糖、醋酸钠。 无机盐：主要是保持渗透压、缓冲pH的变化，并积极参与细胞代谢。一般加入NaCl,KCl,MgSO4,CaCl2,NaH2PO4, NaHCO3等。还有FeSO4,CuSO4,ZnSO4等,其 他成分：合成核酸的前体物质，如腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷。还要加入动物血清，如5-10%的小牛血清，作用机理不明。 加入动物血清可能主要是为了： A 提供细胞生长增殖所需要的各种生长因子和激素； B 提供有利于细胞贴壁所需要的贴附因子和伸展因子； C 提供可识别金属、激素、维生素、脂类的结合蛋白； D 提供细胞生长所必需的脂

11、肪酸和微量元素； E 提供良好的pH缓冲系统,3、无血清培养基 优点： A、提高细胞培养的可重复性避免了由于血清批次之间的差异； B、避免了由于血清带来的病毒、真菌、支原体微生物等的污染； C、供应充足、稳定； D、产品易于纯化； E、避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性； F、减少了血清中某些蛋白对生物测定的干扰，便于实验结果的分析,无血清培养基中一般需要加入： A、激素和生长因子； B、结合蛋白； C、贴附和伸展因子； D、其他利于细胞生长的因子和元素：如消除氧自由基损害的谷胱苷肽，微量元素如硒等,一、动物细胞大规模培养的方法 根据培养细胞的种类分为原代细胞培培养和传代细胞培养，也可以根据

12、培养容器和方式的不同分为静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固体床和流化床培养等。 1、悬浮培养： 适用于一切非贴壁细胞的培养，也适应于兼性贴壁细胞。 优点：操作简便。培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模。 缺点：由于细胞体积小，很难采取灌流培养，因此细胞密度一般比较低,第四节 动物细胞培养的方式和操作方法,2、贴壁培养 适用于贴壁细胞和兼性贴壁细胞。 优点：适应于细胞种类广，因为生产中使用的大多数细胞都是贴壁细胞，较易采用灌流培养，细胞密度高。 缺点：操作比较麻烦，需要合适的贴壁材料和足够的面积，培养条件不易单一，传质和传氧较差。不便进行扩大培养。 贴壁培养

13、在传代和扩大培养时需要用酶将细胞从基质上消化下来。常用的消化物有：胰酶、EDTA、胰酶柠檬酸盐、胰酶-EDTA联合使用。其他如胶原酶、链霉蛋白酶、木瓜酶等。他们的作用主要是使细胞间质和一些促使细胞贴壁的蛋白因子水解，使细胞从基质分离成单个细胞,3、贴壁悬浮培养（也称假悬浮培养） 是将贴壁培养和悬浮培养二者结合，优势互补，形成更理想、更适应于工业化生产的培养方法。 （1）微载体培养 采用葡聚糖SephadexA50微颗小粒培养贴壁细胞。 优点：可创造相当大的贴附面积，供细胞贴附生长增殖。由于载体体积小，比重轻，可经轻度搅拌即可微小颗粒携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥悬浮培养的一切优点,葡聚

14、糖凝胶专用柱,理想的微载体应该具备的条件： A、微载体表面性质与细胞有良好的相容性，适于细胞附着、伸展和增殖； B、微载体的材料无毒性。对培养细胞无毒性，还要不会产生影响产品和人体健康的有害因子； C、微载体的材料是惰性的，不与培养基成分发生化学反应，也不会吸收培养基中的营养成分； D、微载体的比重在1.0301.045g/ml，使载体在低速搅拌下可以悬浮，而静止时又可很快沉淀，便于换液和收集； E、粒径在60-250m（溶胀后）之间为好，且要尽可能均一，差异不大于20m。有利于细胞均匀分布在各微载体表面； F、具有良好的光学透明性，适于在倒置显微镜下观察细胞在载体上的生长情况； G、基质是软

15、的，避免在搅拌中载体互相摩擦而损伤细胞； H、可耐120高温。便于采用高压蒸汽灭菌； I、经简单的适当处理后，可以反复多次使用； J、原料充分。制作简便，廉价,目前微载体的材料有两类： 一类在载体中加入钛，增加比重，适用于流化床反应器。 一类不加钛，比重较轻，可与固体微载体一样，用于搅拌罐式生物反应器或气升式生物反应器。 （2）包埋和微囊培养 细胞不是贴附在载体表面。而是包裹在或包埋在凝胶载体或微囊内。如果包埋的凝胶载体较大，就称为巨载体培养。 微囊培养是在包埋培养的基础上衍生而来的，即将包埋的颗粒经液化处理而成为微囊,包埋材料的类型： A、人工合成的高分子聚合物： 聚丙烯酰胺、环氧树脂、聚氨

16、基甲酸酯、聚乙烯醇等。 B、糖类： 纤维素、琼脂、琼脂糖、K卡拉胶、海藻酸钙、脱乙酰几丁质等。 C、蛋白质： 胶原、明胶、纤维蛋白等。 这些材料是靠温度的变化来变相的，如海藻酸钙，在钠盐时是液态。形成钙盐时则形成凝胶。 凝胶的制备常常是在形成凝胶后，再用另外一种电荷相反的材料与之作用，使载体外形成一层聚合膜，然后再使膜内的载体液化,包埋和微囊培养的优点： A、包埋或包裹在载体或微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害； B、可获得较高的细胞密度。一般在107108细胞/ml； C、控制微囊膜的孔径，可使产物浓缩在微囊内，有利于下游产物的纯化； D、可采用多种上午反应器进行大规模培养，如搅拌罐

17、式生物反应器、气升式生物反应器。用包埋法，当颗粒直径较大时，可采用固定床式生物反应器,3）结团培养 利用贴壁细胞有结团的特点，用搅拌反应器和罐流培养的方式获得高密度的细胞，开创了细胞结团培养的新方法。 其实质是用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法进行培养，也是一种贴附悬浮培养。为了加速细胞结团，往往加入一些直接较小的微粒，促使细胞先附着其上，再相互附着。 优点：操作简便，节省了用于微载体的成本,二、动物细胞培养的操作方式 1、分批式操作 有两种情况： 一是将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养，使细胞增殖到一定密度，产物达到一定量后将培养基和细胞一并取出。 另一种方式是先将细胞和培

18、养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，向反应器内加入诱导剂或病毒，经过一段时间作用后，取出反应物。 2、半连续式操作 将细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物，然后补充同样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。该方法被广泛采用，优点是： 操作简单、生产效率高，可长期进行生产，反复收获产品，能使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平,3、灌流式操作 将细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断将条件培养基取出，同时不断补充新鲜培养基。它与连续式操作不同之处是取出部分条件培养基时，绝大部分细胞仍保留在反应器内，而连续式培

19、养则同时也取出了部分细胞。 优点： A、细胞可处在较稳定的良好环境中，培养条件较好，有害代谢废物浓度低； B、可极大地提高细胞密度，使产量大大提高； C、产品在罐内停留时间缩短可及时收留在低温下保存，有利于产品质量的提高； D、培养基的比消耗率较低，且产量质量提高，生产成本明显降低,一、理想的动物细胞反应器必须具备的要求 1、制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基、细胞直接接触的材料必须无毒性； 2、生物反应器的结构必须使之具有良好的传热、传质和混合性能； 3、密封性能良好，可避免一切外来微生物的污染； 4、对培养环境中多种物理化学参数能自动检测和调控； 5、可长期连续运转； 6、容器

20、内表面要求光滑，无死角，以减少细胞或微生物的沉积； 7、拆装、连接和清洁方便，能耐高压蒸汽消毒，便于操作维修； 8、设备成本低,第五节 动物细胞生物反应器及其检测控制系统,二、动物细胞生物反应器的类型 1、搅拌罐式反应器：是借鉴细菌发酵罐改造而来，是最早的动物细胞生物反应器。特点：能供氧、搅拌速度慢、采用无气泡系统、配置有进出料系统。 2、气升式生物反应器 特点：气体从罐底的导流管进入，使液体形成循环流。具有剪切力小、混合均匀、氧和营养的传递好、利于密封等优点。 3、中空纤维式生物反应器 该反应器由数百至数千根中空纤维集束组成。材料为聚砜或丙烯共聚物。 4、透析袋或透析膜式生物反应器 主要是能够将分子量小而对细胞生长和产物的产生有抑制作用的乳酸、氨等透析或滤掉。 5、固定床或流化床式生物反应器 特点：结构简单，添装材料是对细胞无毒、又有利于细胞贴附的材料。现用于大量生产疫苗和基因工程产品,一、改进表达载体，提高表达水平和产量 1、采用杂交瘤技术，提高细胞表达量。 2、采用更强的启动子和增强子。 3、