应用微生物：第三章 第二讲 现代微生物肥料

1、第三章 微生物与农业第二节 微生物肥料microbialmanure,http:/,第一节 概述,微生物肥料的概念： 是一类含有活的微生物的特定制品，应用于农业生产中，能够获得特定的肥料效应，能增加植物产量或提高产品质量的微生物制剂。 在这种效应的生产中，制品中的活的微生物起关键作用，符合上述定义的制品均应归入微生物肥料。 陈华癸教授，华中农业大学 或者：微生物肥料是指一类含有活的微生物并在使用后能获得特定肥料效应，从大气中固氮，增加铁、磷等矿质元素吸收或合成植物激素，直接促进植物生长的微生物制剂,发展微生物肥料的必要性,首先，化肥使用量逐年增加，化肥利用率和增产效益下降；我国单位面积施用化肥

2、量是日本的2倍，美国的2.4倍，加拿大的4.4倍，澳大利亚的8.2倍，俄罗斯的9.0倍！化肥利用率仅为30%！应用化肥引起水质和环境污染。 第二，土壤肥力下降，土壤退化荒漠化逐渐加剧； 第三，土壤生态环境恶化，土壤生态功能下降； 第四，中国化学肥料资源严重不足，这对农业的可持续发展构成了严重的挑战,开发和应用微生物肥料的意义,土壤肥力的改良； 节约能源，保护环境： 1、提高化肥的利用率，即提高了能源利用率； 2、本身无毒害作用，不污染环境； 3、减少土壤营养流失和富营养化的产生。 4、可以此实现固体废弃物资源化_堆肥。 可持续发展的要求,我国微生物肥料的研发历程,我国自50 年代从国外引进自生

3、固氮菌、磷细菌和硅酸盐细菌制剂。 从豆科植物上应用根瘤菌接种剂开始的，起初只有大豆和花生根瘤菌剂。 60 年代推广使用放线菌制成的“5406”抗生菌肥料和固氮蓝绿藻肥。 7080 年代中期，开始研究VA 菌根，以改善植物磷素营养条件和提高水分利用率。 80 年代中期90 年代，农业生产中又相继应用联合固氮菌和生物钾肥作为拌种剂。微生物肥料研制单位相继推出联合固氮菌肥、硅酸盐菌剂、光合细菌菌剂、PGPR 制剂和有机物料(秸秆)腐熟剂等适应农业发展需求的新品种,微生物肥料的主要功效与机理,一、增加土壤肥力，促进植物对营养元素的吸收 1、氮磷钾大量元素营养：根瘤菌、自生和联合固氮菌；硅酸盐细菌的解钾

4、作用。 2、土壤中大量微生物的活动使土壤有机质转化形成腐殖质，促进土壤团粒结构的形成，提高土壤肥力，改善土壤理化形状，增强土壤保肥、保水能力，从而提高作物的产量和品质,二、分泌多种生理活性物质刺激调节植物生长： 大量研究表明，微生物活动产生的植物生长调节物质以及维生素都不同程度地刺激和调节植物的生长。 1、分泌植物激素 生长素、赤霉素、脱落酸、乙烯和酚类物质； 2、酸类物质的产生：有机酸的作用,微生物肥料的主要功效与机理,三、对有害微生物起到生物防治作用： 通过在植物根际大量生长繁殖成为作物根际的优势菌，与病原微生物争夺营养物质，在空间上限制其它病原微生物的繁殖机会，对病原微生物起到挤压、抑制

5、作用，从而减轻病害。这类微生物也叫做根圈促生细菌（PGPR,微生物肥料的主要功效与机理,四、产生抗病和抗逆作用，间接促进植物生长： 1、产生多种抗病物质：抗生素 2、提高植物的抗逆性：由于微生物肥料的施用，其所含的菌种能诱导作物产生超氧化物歧化酶，在植物受到病害、虫害、干旱、衰老等逆境时，消除因逆境而产生的自由基来提高作物的抗逆性，减轻病害,微生物肥料的主要功效与机理,第二节 微生物肥料的种类,微生物肥料按作用机理分： 固氮菌类肥料（根瘤菌肥料、自生固氮菌肥、固氮蓝藻等） 解磷菌类肥料 解钾菌类肥料（硅酸盐细菌） 促植物生长菌剂（铁载体、抗生素、促生长素） 堆肥菌剂和发酵菌剂 复合微生物肥料,

6、一. 固氮菌肥_根瘤菌肥料,根瘤菌是含有大量根瘤菌活菌体的生物制剂，接种于豆科植物种子上，在土壤条件适宜情况下，根瘤菌能在豆科植物根际进行活跃的生命活动，并侵入豆科植物根部结瘤，固定空气中的氮素为NH3或NH4+。 根瘤菌肥料是用人工选育出来的高效根瘤菌株经大量繁殖用载体吸附制成的，是迄今为此世界上研究最早、应用时间最长、生产量最多、应用最广泛和效果最稳定的微生物肥料之一,根瘤菌与豆科植物间的共生,形成根瘤共生体,根瘤菌固定大气中的气态氮为植物提供氮素 养料,豆科植物的根的分泌物能刺激根瘤菌的生长， 同时，还为根瘤菌提供保护和稳定的生长条件,生物固氮在氮循环中的作用,Root Nodule B

7、acteria and Symbiosis with legumes豆类,Soybean root nodules,Unnodulated soybean,Nodulated soybean,根瘤固氮菌一般生理特性： 化能有机营养型能：利用NO3-、NH4+，但培养基中含植物性氮素物质（豆芽汁、酵母汁等）时大多数根瘤菌生活得更好。需要多种灰分元素：P素的要求尤其高；铁是合成豆血红蛋白和铁蛋白的必要元素。钼是固氮酶的成分。适合中性和微碱性条件，适合的pH在6.5-7.5，适合的温度25-30,根瘤菌与宿主的共生特性： 侵染性：根瘤菌能进入豆科植物根内，在其中繁殖，并形成根瘤。 专一性：每一种根瘤

8、菌只与其有专一性对应的几种豆科植物建立共生关系形成根瘤,K. pneumoniae （Nif+）固氮相关基因 20个基因，分为8个独立的操纵子，分布在约24kb大小的区域内 K. pneumoniae nif操纵子结构示意图 固氮基因及其编码的蛋白 基因名称 编码蛋白的功能 nifD、nifK 固氮酶组分 nifH 固氮酶组分 nif F 黄素氧还蛋白 nifG 丙酮酸黄素氧还蛋白氧化还原酶 nifQ.B.N.E.V 铁钼辅助因子的合成 nifM 氮气还原酶的加工和折叠 nifS 固氮酶组分的翻译后加工 nifA 正调节因子 nifL 负调节因子 nifW.Z.TY.U.X 功能目前尚不清楚,

9、8个独立操纵子，共编码20种不同蛋白质。大部分蛋白是对固氮酶组分的辅助性蛋白或电子传递蛋白 nif基因的严格控制： （1）孤单过程消耗大量能量； （2）细胞内含氧量，NH3浓度是调节固氮反应的主要因素； nifA是正调控基因： （1）编码正调控蛋白NifA； （2）NifA和其它操纵子的特定序列结合，促进表达nifL，是正调控基因： nifL是负调控基因： （1）编码负调控蛋白NifL； （2）在有氧和有固定氮源情况下，NifL作为NifA的拮抗物，阻遏固氮基因表达。 固氮基因的基因工程 为提高固氮效率进行基因工程研究： 1、调控基因基因工程研究 2、氢化酶基因工程研究 3、结瘤基因基因工程研

10、究,1、固氮正调控基因nif A的基因工程,2、氢化酶及氢化酶基因工程 1、氢化酶（Hydrogenase)的发现 20世纪70年代中期发现，大豆慢生根瘤菌Bradyrhizobium japonicum的某些菌株，在低氧条件下用氢气作能源生长，这些菌株内发现氢化酶。 H2 H+e ATP 有氢化酶菌株（Hup+） 无氢化酶菌株（Hup） 2、氢化酶与固氮的关系 发现大豆植株（接种Hup+）生物量大豆植株（ Hup） 大豆根瘤菌利用氢气的菌株在共生固氮的同时，提高了促进大豆植 株的生长能力。 为什么,有氢化酶的大豆根瘤菌株能够重新利用根瘤菌固氮酶产生的H2，节约能量，促进了植物生长,自然界中R

11、hizobium和Bradyrhizobium大多数菌株是Hup。 Hup菌株不能利用固氮时放出的H2，而降低固氮效率。现在用的固氮 Rhizobium菌肥多是Hup，如何用基因工程改造为Hup+,hup 导入 豌豆根瘤菌（Hup） Hup工程菌 Hup+工程菌株接种豆科植物Hup菌株，使得豆科植物长得更高大，氮含量更高。 引入hup基因的根瘤菌对植物固氮能力影响 hup基因工程操作尚存很多困难，但应用潜力和前景巨大,结瘤微生物之间的竞争 商品化的固氮根瘤菌是突变株：固氮能力强，结瘤能力弱。 土壤中野生型菌株：结瘤能力强，固氮能力弱。 基因工程株的方向 保持高固氮能力的同时，增强结瘤能力,3、

12、结瘤基因工程菌,R. meliloti的结瘤基因（nodulation gene） 整个结瘤过程需1520个基因共同作用和调控。 结瘤基因分三类： 非特异性结瘤基因：nodA，B，C等，不同种的根瘤基因相同。 特异性结瘤基因：有根瘤种的特异性。 调控基因：nodD,每种豆科植物根分泌自己特定的某一种类黄酮分子,Nod D（蛋白）共生植物类黄酮分子复合物,结瘤基因的表达与根瘤形成,根瘤菌肥的生产,拌种剂和复合肥料。 拌种剂：粉状、液体、冻干粉。 复合肥料：同一根瘤菌属的不同菌株复合，或与其他微生物合用以增强结瘤能力。 生产过程： 菌种培养固体扩大收集菌泥制菌粉装瓶 液体扩大吸附剂拌种装袋,2.

13、自生固氮菌肥料,单独生活时能固定空气中的氮的一类微生物称为自生固氮菌，分为光合细菌和非光合细菌。 主要类群：蓝细菌、圆褐固氮菌、假单胞菌、多黏芽孢杆菌等。 固氮能力比共生固氮差,自生固氮微生物：蓝细菌 能与其它生物共生固氮的蓝细菌主要分布在鱼腥藻属和念珠藻属，这两个属的蓝细菌可以与真菌、苔藓、蕨类植物及高等植物共生固氮。蓝细菌与水生蕨类植物共生固氮的现象在农业生产中也常有利用，例如蓝细菌可以与红萍共生后形成一种很好的绿肥。与鱼腥藻共生的红萍可以在稻田中生长，不仅能通过其固氮作用给水稻提供氮源，提高稻田土壤的肥力，还可以抑制稻田中其他杂草的生长,自生固氮微生物：圆褐固氮菌,圆褐固氮菌代谢类型是,

14、异养需氧型,圆褐固氮菌能产生生长素，促进植株生长和果实的发育,3、其他固氮微生物 （1）、弗氏放线菌 弗氏放线菌Frankia属，它可以与多种木本植物共生，并与之共生的植物根部产生根瘤。这种菌一般利用简单的有机酸作为碳源，而不能利用糖类物质。绝大部分都可利用氮气作为唯一氮源，且其固氮酶对氧气的耐受性略高于根瘤菌的固氮酶。目前，已经有用弗氏放线菌提高了杨树林、杞木的生长能力的报道,2）、具有联合固氮作用的细菌 有些具有固氮能力的细菌聚居在植物的根际、根表或根层细胞间，但是又不形成象根瘤这样的共生结构，这种情况下的固氮作用称为联合固氮作用。联合固氮作用的效率很低，仅为共生固氮的1/10,磷素是作物

15、生长发育所必需的营养元素之一。虽然土壤中磷含量很高，但能被植物吸收利用的有效态无机磷却很低，土壤中绝大部分磷为无效磷。 磷是许多发展中国家农业生产重要的限制因素，提高土壤中磷的利用效率将具有战略性意义,二. 解磷菌肥料,解磷微生物菌剂 能分解土壤中难溶态磷的细菌制成的解磷细菌肥料，使解磷细菌在作物根际形成一个磷素供应较为充分的微区,细菌解磷机制,解磷微生物溶解难溶性磷化物的机制可归结为以下几类： (1)分泌有机酸起作用：这些酸既能降低pH 值，又可与铁、铝、钙等离子结合，从而使难溶性磷酸盐溶解；通过代谢活动产生有机酸(细菌一般分泌乳酸、氨基酸、草酸、延胡索酸和柠檬酸等，真菌主要分泌草酸、丙二酸

16、和乳酸等)，这些酸一方面直接溶解土壤中难溶性磷酸盐。 (2)有机酸另一方面则是通过鳌合作用释放出土壤磷素：腐解植物残体而产生胡敏酸和富里酸。这两种酸能与复合磷酸盐中的钙、铁鳌合，从而释放出磷酸根，与铁、铝及磷酸盐形成稳定的可溶性复合物，可以被植物吸收利用。 (3)生物矿化作用。即通过分泌植酸酶、核酸酶和磷酸脂酶等物质，分别将植酸、核酸和磷酸脂等有机磷降解,巨大芽胞杆菌（ Bacillus megatherium var.phosphaticum,1. 菌体形态特征：此菌的菌体实在粗大，因而拉丁文学名称其为为巨大芽孢杆菌。 2. 芽孢形态特征： 有大芽孢，椭圆形偏端或中位；孢囊多为背端生，芽孢内

17、不着色，无色；成熟孢囊不膨大。 3. 菌落形态特征：在专用培养基上菌落圆形，有同心圈，表面光滑；菌落不透明，由灰白色变棕黄色，边缘整齐；菌落扁平，微隆起微绉折。 4. 生理生化特征：革兰氏染色阳性；在肉汤培养基中生长很快，有较强分解核酸和卵磷脂的能力，也能从难溶的无机磷灰石中释放出正磷酸盐,解磷能力的测定,解磷能力是表征解磷微生物作用的重要指标，可采用定性法和定量法两种方法测定。 定性法一般指的是平板溶磷圈法; 平板溶菌圈法：将溶磷菌株在含有难溶性磷酸盐或有机磷的固体平板培养基上培养，测定周围菌落产生透明圈的大小。无机磷平板一般采用磷酸钙盐固体培养基，接种菌株培养数天后，以磷酸钙盐平板上菌落周

18、围出现透明圈的视为有解无机磷能力的菌株。有机磷平板一般采用卵黄平板培养基，以卵黄平板上菌落周围出现混浊圈的视为有解有机磷能力(卵磷脂被水解形成脂肪和磷酸,溶磷圈直径（D）和菌落生长直径(d)的比值(D/d)是表征解磷菌相对解磷能力的一个指标,解磷微生物的种类,解磷细菌： 芽孢杆菌属(Bacillus) 欧文氏菌属(Erwinia) 假单孢菌属( Pseudomonas) 土壤杆菌属(Agrobacterium ) 沙雷氏菌属(Serratia ) 黄杆菌属( Flavobacterium ) 肠细菌属( Enterbacter) 解磷真菌：青霉属( Penicillium ) 、曲霉属(Asp

19、ergillus) 、根霉属(Rhizopus) 、镰刀菌属( Fusarium ) 、AM 菌根菌,三、解钾细菌菌肥,解钾细菌，又称硅酸盐细菌,解钾细菌，又称硅酸盐细菌,解钾细菌具有荚膜，为多糖类物质，促进土壤微团聚体的形成,解钾细菌还能将土壤中的无效率转化为有效磷；并有微弱的固氮能力,胶质芽孢杆菌,四、促进植物生长菌剂,一、促植物生长的有益细菌 促植物生长的三种方式： （一）分泌铁载体（siderophores） 1、荧光假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 分泌铁载体，在这种铁载体的一个荧光生色团上连接有由L和D型氨基酸交替组成的六肽,CH3,荧光生色基团连接六肽 假

20、单胞菌素（Pseudobactin）就是这样一个铁载体，它有极强的铁亲和力，亲和常数可达到1025L/mol,2、铁载体的功能 在缺铁条件下，假单胞菌分泌铁载体，与环境中的Fe3形成铁载体Fe3供假单胞菌重新吸收。 降低了植物根系附近的Fe含量，导致植物病原菌和有害微生物“铁饥饿”而被抑制，间接促进植物生长。 植物也可直接利用与铁载体结合的Fe3，直接促进植物生长,3、铁载体基因克隆与基因结构,恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）获得28个铁载体合成缺陷突变株（sid）。 P. Putida sid鉴定特征： .U.V.照射下菌株细胞不产生荧光 .含有2，2联吡啶环境中不生长,二）分泌抗生素（Antibiotc）或杀真菌剂（fungicide），抑制植物病原菌，间接促植物生长,5406 菌肥，又称放线菌肥料，是在放线菌肥料研制之初以“5406”号放线菌为主要菌种加入到载体之中制成，所以称为5406 菌肥，简称“5406”。 5406 泾阳链霉菌的生物学特性： 菌落圆形、凸起，开始生长时浅黄色至淡红色。气生菌丝粉白色，上面生满成串孢子呈粉红色。最适生长温度为2632,三）分泌植物生长激素，直接促植物生长 赤霉素（gibberellin）是从藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）的无性世代串珠镰刀菌中发现的。 次生代谢产物 赤霉素除赤