无菌工艺验证-培养基模拟灌装试验【高教课件】

1、培养基灌装试验方案,Luisa Stoppa,无菌药品生产SFDA GMP 检查员高级研讨会 Nanjing, the Peoples Republic of China 16-20 November 2009,培训目的,评估无菌生产模拟试验（培养基灌装或肉汤灌装） 了解在培养基灌装试验方案设计过程中的关键点，以符合法规要求 学会如何对失败进行评估，以及可能带来的后果 在团队中进行讨论,无菌生产工艺,培训目的,培养基灌装的原则,为什么无菌工艺的验证必须符合制药行业的规范？ “无菌药品”的含义是“没有活体微生物” 在无菌检测过程中，实际上并没有对每个产品进行检测，所以应采取所有努力减少污染的风险

2、(洁净厂房、 HVAC 、压差、清洗程序、监测计划) 尽管采取这些措施，但污染永远是一个潜在的风险，因为无菌工艺操作是在一个受控但是非灭菌的环境中进行的，并且样品取样数量太小，所以只有严重污染才可能被发现,培养基灌装的原则,制药相关法规 : - 法规：FDA “,无菌生产工艺 生产无菌药品的行业指南 cGMP” - - EU GMP Part I 附录 1 - PIC/S PI 007-2 “无菌生产工艺验证指南” 虽然培养基灌装试验必须复制无菌生产条件，但是模拟试验与药品实际生产过程采取完全相同的方式是不可能的。 什么培养基？灌装多少数量？多长时间,培养基灌装的原则,在无菌生产工艺中，最大的

3、风险来源于洁净室中人员的操作，所以操作人员必须参加培养基灌装试验。 操作人员需要什么样的资质？以及什么时候可以确认操作人员的合格性？ 在无菌灌装操作中，应进行环境监测。 是否需要额外的监测措施,培养基灌装的原则,通常情况下，应该包括产品实际操作过程中可能发生的“最差条件” 必须考虑可能采取那些干预措施 ,清洗设备,隧道烘箱,灌装设备,压塞机,压盖机,模拟试验: 液体无菌灌装生产线,模拟试验: 培养基灌装方案,需要考虑的关键因素 : 试验的数量和频率 培养基 (产品的替代品) 灌装的数量 容器 (玻璃瓶) 体积 灌装体积 生产速度(或 灌装速度) 灌装过程的持续时间 工作班次 监测措施 干预措施

4、 常规的和非常规的 培养方法 可接受标准,模拟试验: 培养基灌装方案,关键因素: 试验的次数和频率 培养基模拟试验的初始验证，至少需要成功的连续进行 3 次独立的模拟试验（建议在不同的工作日进行试验）。 首次验证后，培养基模拟试验通常每年进行2次。 当生产线发生变更，并且经过评估可能对无菌生产工艺有潜在危险时，应当进行额外的培养基灌装试验,培养基灌装方案,关键因素: 培养基 (1/3) 培养基必须适应广谱微生物的生长，包括需氧菌、酵母菌和霉菌（非选择性培养基）。 推荐使用大豆消化酪素琼脂培养基(SCD) ，以及大豆胰蛋白胨肉汤(TSB). 如果产品在缺氧条件、通常在氮气保护下灌装时，需要使用厌

5、氧培养基:液体硫乙醇酸盐培养基(FTM,培养基灌装方案,关键因素: 培养基(2/3) 培养基必须适应微生物的生长（促生长试验）。被试验的微生物可以从药典 (美国、欧盟、日本)中选择。另外推荐使用12种最常见的环境分离菌。 通常情况，在培养结束后，一些玻璃瓶（从生产开始、中间、结束时取样）进行微生物接种，接种量100CFU，分别培养3天（细菌）和5天（酵母菌和霉菌,培养基灌装方案,关键因素: 培养基(3/3) 如果培养基中含有动物源性成分，可能导致朊蛋白污染。那么很重要的是，培养基供应商能够提供证明，确认相关物质来源于没有牛海绵状脑病（BSE-free）的国家 。 另一种方法是可以使用从植物中提

6、取的TSB培养基。 SDC 粉末通常遭受支原体的污染，并且无法在无菌过滤中去除。在这种情况下，可以在粉末灌装前，对粉末进行灭菌（使用射线,培养基灌装方案,关键因素: 灌装数量 灌装的数量应该能够真实的反应批量；但允许根据需要，采取最低灌装数量，前提是应足以反应操作员工疲劳时对产品质量潜在的影响 ，并且足以体现了尽可能发生的干预措施。 一些法规中建议应该根据批量确定灌装的数量,培养基灌装方案,关键因素: 容器体积(1/2) 应该考虑到灌装容器的极端尺寸。 最大的容器（通常由于充填体积较大而导致最小的充填速度）通常开口较大，所以从环境中微生物侵入的潜在风险是最大的。 最小的容器（通常由于充填体积较

7、小而导致最大的充填速度）体现了最大的操作难度；小的容器更容易破碎，稳定性差，在设备中更容易破裂或堵塞,培养基灌装方案,关键因素: 容器体积(2/2) 在最初的验证中，可以二次选用最大的容器，第三次选用最小的容器。 在日常的评估中，其它规格尺寸的容器也应该包括在验证计划中。 不能使用琥珀色的容器，而应该使用透明的容器，保证可以目视检测到微生物的生长,培养基灌装方案,关键因素: 灌装体积 培养基灌装体积不需要与现实中常规的灌装体积一致。 应确定足够的灌装体积，保证可以充分接触到容器密封部位的表面(当它倒置和旋转时)，并且足以目视检测到微生物在培养后的生长情况。 较小的容器不能灌装的太满，因为容器上

8、部的空间中应保持足够的空气，以支持需氧微生物的生长（通常应该保留25%的空间,培养基灌装方案,关键因素: 生产线 (或 灌装) 速度 培养基灌装的速度，应符合实际生产的灌装速度范围。如果超过了限度，应该进行评估。 每次模拟试验中确定的速度应该是符合要求的。 较高的生产速度，可以适用于生产过程中经常受到干扰或手工操作较多的生产工艺。 较低的生产速度，可以应用于在无菌区域中无菌部件长时间暴露的生产工艺。 在灌装生产线的起始验证中，一次可以选用最低速度，另外二次可以选用最高速度。 在生产线的日常评估中，模拟试验的速度应该进行变换,培养基灌装方案,关键因素: 灌装的持续时间 即使使用最精确的模型模拟实

9、际生产运行，其他的因素也需要考虑，以确保其合理性。 通常情况，培养基灌装的时间应该足够长，能够包括所有的必需的干扰、生产中断，以及反应出潜在的人员疲劳，一个典型的培养基灌装可以至少是3-4小时。 一次理想的培养基灌装应该灌装比实际产品生产时更多的数量（所有的批次均应大于5000个单位）。对于非常大的批量或较长的生产过程，通常使用一些空白样品（空的或者灌水）以维持模拟试验的动态环境。这些技术可以应用于持续多个工作日的工艺验证，用于验证可以批准的最长的生产周期,培养基灌装方案,关键因素: 工作班次 需要进行无菌工艺操作的每个操作员工都必须参与培养基灌装试验。 设备和生产线的操作员工应该每年参加不少

10、于一次的模拟试验；其它操作员工比如设备工程师和环境取样人员也应该采取相同的方式。 应该确定无菌操作间可以最多容纳的操作人员数量。 当一个公司有多个班次工作时，第二个班次、第三个班次也应该包括在培养基灌装试验的计划中。 如果手工操作（灌装），每条生产线的员工都应该参加开始的三次验证；在再验证（每6个月1次）过程中，至少有一条生产线的员工参加,培养基灌装方案,关键因素: 环境监测措施 在许多法规和制药规范中，都提出了对微生物的要求。 在试验过程中，可以使用主动采样或被动采样的方法进行空气采样；表面采样最好在无菌操作结束后进行。另外还应该对操作人员进行监测。 在培养灌装过程中，微生物监测（空气、表面

11、、人员）和悬浮粒子监测应该按照各自的操作规程有效的进行。 有时候，取样点的数量可以较日常监测适当增加,培养基灌装方案,关键因素: 干预措施 常规的和非常规的- 干预措施应该模拟实际运行时可能发生的情况；培养基灌装记录中应该记录所有发生的干预措施，以及被移走产品的数量。 常规的干预措施：对于无菌生产线的安装，如果已经灭菌的部件脱离保护措施而被安装的话，是一个潜在危险。因此，开始灌装的容器更容易反映出无菌设备装配的潜在问题。 其它的常规干预措施：胶塞供给， 移走掉落的玻璃瓶, 移走堵塞的胶塞，人员的停顿，换手套，环境的监测。 非常规的干预措施（意外发生）：玻璃瓶破裂，灌装针头的更换或重新安装，称量

12、调整的干预，传感器故障，传输带的调整,培养基灌装方案,关键因素: 培养方法 任何灌装的产品都应该在培养前进行检查，发现任何不合格品（如容器密封性存在问题或完整性不好）时，都应该被剔除并记录。 行业规范中不同的要求: 全部样品应在20-35(2.5)下培养14天。通常在 20-25下 培养 7 天，然后在30-35下培养 7 天；或者在30-35培养 7 天后，再转移到 20-25培养 7 天。 关于培养条件的选择，补充一个没有形成共识的建议，在培养过程的前半个周期，将所有产品进行倒置后培养；然后在剩余时间内，将产品恢复直立位置后进行培养,培养基灌装方案,关键因素: 可接受标准 试验的目标是不出

13、现长菌（阳性为0），但置信度为95时，污染率应小于0.1% (在5000个灌装单位中，大约有1个被污染)。 FDA 和PDA 要求，不管试验的数量，被污染的产品数量都应该是0。 很重要的一点，培养基灌装试验的失败是十分罕见的。 发生任何微生物污染时，均应进行调查,培养基灌装方案,关键因素: 可接受标准,培养基灌装方案,表格显示了培养基灌装试验中，不同灌装数量时，按照置信度为95、污染率应小于0.1%计算，可以允许的最大污染数。 加拿大卫生部 Health Canada,污染,发生失败 (污染)时，必须确定最根本的原因，或者至少是最可能的原因。 能够对微生物进行分离和鉴别（鉴定到种），这一点非常

14、重要。 实施适当的纠偏措施和预防措施 必须评估失败对已经放行批次（如果有的话）的影响 当纠偏措施实施后，应该进行一次新的培养基灌装试验，以确认其有效性,污染 率,灌装过程(时间或灌装量,污染,在灌装过程中污染率上升,这表明污染可能来源于液体培养基 (如与培养基贮罐非无菌连接，在循环管路中受到污染)。很重要的是，在灌装结束后，保持培养基贮罐处于无菌状态，当等到培养基灌装结果时，可以核实这样的假设,污染率,灌装过程(时间或灌装量,污染,在灌装过程中污染率下降,这表明污染发生于生产设备中（ 胶塞容器/ 轨道, 计量泵 / 针头)，在灌装过程中污染被部分或全部“清洗掉,污染率,灌装过程(时间或灌装量,

15、污染,在灌装过程中污染率出现尖峰,一个尖峰（在短时段的一些产品被污染）可能与在灌装过程中不正确操作导致的关键失误有关。 对于这个原因，很关键的是必须知道被污染产品灌装的准确时间，以及当时实施的干预措施（灌装操作过程的录像是非常有用的,污染率,灌装过程(时间或灌装量,污染,污染率出现尖峰后，呈上升趋势,与前面的例子相同，但如果错误的干预措施能够影响到液体的管路/回路时（如培养基贮罐的变化，泵或针的替换,污染率,灌装过程(时间或灌装量,污染,孤立事件(试验中少数污染,不幸的是，这些现象是最普通的，也是最难调查的。如果这种现象在多次试验中反复出现，可能说明这个工艺存在“环境噪声”，所以需要根本的措施（如 更衣/着装、消毒剂和气流模式的改变,污染,污染,结论,即使一个公司培养基灌装试验是阴性的，也不能完全说明所有产品都没有被污染，因为培养基灌装试验要求的频率太小，没有统计意义。 一个可靠的培养基灌装试验对于工艺验证是十分必要的步骤。 必须实施全面质量保证（HVAC确认