2003秋季高级生化技术教程.ppt

1、2003秋季高级生化技术教程,Platform Technologies of Biology生物技术平台的两根支柱,细胞培养技术 与 单克隆抗体技术 水生所： 张 奇 亚,一、 细胞培养技术 （一）简介与回顾,1859年，法国解剖学家Vulpian将蛙胚尾部组织放到水中进行“培养”， 观察到生长和分化现象。 1885年，德国学者Roux 用生理盐水使鸡胚髓板组织存活了几天， 提出了“组织培养”的概念。 1897年，Loeb 在有血浆凝块的试管中培养兔肝、肾、甲状腺和卵巢植块， 这是最早的器官培养。 1907年，实验胚胎学家Harrison 在无菌条件下，将蛙胚髓管接种于蛙淋巴液中，使之在体外

2、培养了几周。 提出细胞培养无菌与培养基营养等概念。 19121913年， Burrows等采用动物(如鸡)胚胎浸液等作为营养物， 成功培养了多种动物组织,一、 细胞培养技术 （二） 基本概念,1、体内培养(in vivo culture): 体内培养技术最大限度地模仿了活体结构的自然生长环境。 最常见的体内培养方式就是移植(transplantation)。 2、体外培养 (in vitro culture) : 按结构成分分为细胞培养(cell culture)、 组织培养(tissue culture) 器官培养(organ culture)。 3、细胞株(系)与克隆,一、 细胞培养技术

3、（二） 基本概念,3、细胞系(株)与细胞克隆 原代培养(primary culture) 传代培养(subculture) 细胞系(cell line): 原代培养经传代后形成的细胞群体, 由多个生物学性状不同的细胞群体所组成, 分为: 有限细胞系 (finite cell line，多数是二倍体) 无限细胞系(infinite cell line多数为异倍体) 有的无限细胞系在具永生性同时也有致瘤性，称为恶性转化细胞系,一、 细胞培养技术 （二） 基本概念,3、细胞系(株)与细胞克隆 细胞株(cell strain): 具有特殊的生物学性状或标记，可分为: 有限细胞株(finite cell

4、 strain):不能连续传代或传代次数有限。 连续细胞株(continuous cell strain):可连续传代。 亚株(sub strain): 由原细胞株克隆形成、与原细胞株性状不同的细胞群。 如HeLa细胞的亚株HeLa229、S3，均有相同染色体标志，但对病毒敏感性不同。 细胞克隆(cell cloning)：从一个单一母细胞繁殖出来的细胞群体，细胞克隆 方法包括：稀释铺板法、饲养层克隆法、琼脂克隆法等,无菌室 超净工作台恒温培养箱 离心机例置相差显微镜 水浴箱、解剖剪 镊子（尖头、平头和有钩镊）烧杯 培养瓶离心管 吸管细胞记数板 酒精灯,一、 细胞培养技术 （三）设备和器皿,1

5、、常用设备和器皿,一、 细胞培养技术 （三）设备和器皿,一、 细胞培养技术 （三）设备和器皿,一、 细胞培养技术 （三）设备和器皿,一、 细胞培养技术 （三）设备和器皿,一、 细胞培养技术 （三）设备和器皿,一、 细胞培养技术 （三）设备和器皿,一、 细胞培养技术 （三）设备和器皿,一、 细胞培养技术 （四）方法与步骤,1、细胞培养的条件： 1) 无菌操作2) 培养用液及配制 培养液、缓冲液、平衡盐、消化液、pH调节液等。(举例如何配制？)3) 温度 人和哺乳动物35-37； 温水鱼类25-30；冷水鱼15-25。4) 生长基质 在培养基中添加或在培养器皿表面包被的、 能促进细胞黏附和贴壁的物

6、质称为生长基质。5) 器皿与器械的清洗消毒 物理方法：紫外线、压力蒸汽、高温干热灭菌、过滤除菌、电离辐射灭菌。 化学方法：甲醛、环氧乙烷、乙醇、氯己定、戊二醛、碘伏与碘酊,一、 细胞培养技术 （四）方法与步骤,2、动植物细胞的培养步骤： 切取拟培养的动物器官或大组织块 洗去血污 剔除多余成分切成约1mm3大小的组织块 将所有组织剪碎用于组织培养 蛋白酶溶液消化 机械方法吹打组织块 离心、培养液悬浮 计数、调节细胞密度 用于分离细胞培养,2、动植物细胞的培养例一：例一 乳鼠肾细胞原代培养 准备工作 A 培养用品消毒后，安放在超净工作台内， 紫外线消毒，做好洗手等准备工作. B 点燃酒精灯，用品按

7、布局放置，安装吸管等,a 采用颈椎脱臼法，将一只新生乳鼠处死b 将小鼠进入盛有酒精的烧杯中数秒 c 置超净工作台内,例一 乳鼠肾细胞原代培养,a 打开消毒器械包 用镊子掀起乳鼠腹部皮肤,用解剖剪剪开腹腔,充分暴露腹腔b 用另一镊子轻轻夹起肠管,翻置一侧,充分暴露位于腹腔背壁脊柱,例一 乳鼠肾细胞原代培养,a 取下双侧肾脏,放入消毒培养皿中b 用吸管吸取PBS加入培养皿中,清洗肾脏3次,尽量去掉血污. c 将肾组织用解剖剪剪成几块，再用PBS漂洗，去净血液为,例一 乳鼠肾细胞原代培养,胰蛋白酶消化 将洗净的组织块移入消毒小瓶中,用眼科剪剪切至0.5mm大小的组织块。 加入5-8倍体积的0.25%

8、胰蛋白酶，盖好放入37水浴中消化20-30分钟,注意应每隔5分钟振摇一次。 当组织块变得疏松,颜色略白时，取出置于超净工作台内用吸管反复吹打组织块,使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态 加入1-2ml培养液终止消化，净置片刻，让未消化完的组织块自然下沉,将上部的组织悬液移入无菌离心管中,例一 乳鼠肾细胞原代培养,离心及计数 以800-1000转/分离心8-10分钟,超净工作台内开盖,取上清加入适量培养液,细胞计数后分装； 在细胞瓶(板)上标明细胞名称，代数，日期； 倒置显微镜下观察细胞分散情况后置37孵箱中培养,例一 乳鼠肾细胞原代培养,细胞观察 培养细胞每天观察，检查：A.污染与否? B

9、.细胞生长状态 如见培养液变为黄色且又混浊，为污染;如培养液为桔红色，表明细胞状况良好。在无污染时，24h内有细胞贴壁，圆形悬浮状的细胞延展成短梭状。 培养3-4天，细胞生长繁殖，可见细胞岛形成。细胞透明，颗粒少，界线清。 由于细胞生长旺盛，代谢产物堆积，CO2增多，培养液逐渐变酸呈黄色，但液体澄清，此时应换液,例一 乳鼠肾细胞原代培养,2、动植物细胞的培养例二： 例二 鱼类细胞培养 鱼类原代细胞的培养 A 断尾（或剪腮）放血 B 用0.01高锰酸钾溶液或70的乙醇浸泡消毒30分钟。 C 70酒精棉球擦洗解剖部位 D 剖开腹腔，取出组织，清除粘膜和血液，剪碎， 维持液(Hanks液)或缓冲液(

10、PBS)洗。 E 用0.25胰酶消化(20，30或4， 过夜) F 离心(1000rpm, 10), 弃去消化液。 G 用培养基重悬，计数，分装培养(应在2x104个细胞/ml 以上)。 当原代细胞长成单层后，即可进行传代培养。 传代细胞的培养 A 长成单层的细胞弃去培养基，加胰酶EDTA，消化后弃去消化液 B 加培养基，吹打分散 C 分装培养,甲醛固定法用于细胞固定，适应于一般培养细胞的固定操作步骤：1、用PSB洗 2、加固定液 3、处理5分钟 4、用PSB洗 伊红(结晶紫)染色用于普通细胞染色，操作步骤: 1、用甲醛法固定细胞 2、配染色工作液 3、染5-10分钟 4、用脱色液脱洗5分钟

11、5、固定制片,培养细胞的常用固定与染色方法（举例,培养的鱼类传代细胞及显微观察,结晶紫染色,荧光染料染色,活体细胞,细胞培养技术应用举例：病毒学研究的基本工具,一、 细胞培养技术 （四）方法与步骤 例三 植物原生质体 的培养,植物细胞培养与动物细胞培养的异同： （1）目的与结果一致，模拟体内无菌生长条件，使动植物细胞在体外存活。 （2）材料范围有所不同：植物材料更多 （3）营养条件有异：光照、湿度等。 （4）生长方式不同：植物组织细胞有较强的生长、分裂及分化能力； 动物细胞不能重返全能的未分化特征,一、 细胞培养技术 （四）方法与步骤,例三 植物原生质体的培养 原理：1920年提出的植物细胞的

12、全能性理论。材料：器官、组织、细胞、原生质体。例子：嘌呤/生长素的比率能调控 芽/根的分化 比率，芽形成； 比率，根形成。 茎尖可培育出无病毒株。如茎尖培养脱毒马玲薯苗。条件： 基本与动物组培相同，无菌、营养、渗透压、pH、温度， 还需要： 光照、湿度、气相(当氧时形成胚; 反之成根)。光照对植物组织细胞的作用不是光合作用的能源， 而是诱导植物细胞脱分化与再分化,例三 植物原生质体的培养,制备优质原生质体，多选用根茎尖、嫩叶或生长期的愈伤组织为材料。 花期短的花瓣组织鲜嫩，又具色素标记，是较好的材料,花瓣表面为排列紧密的表皮组织，不易酶解，用尖头镊子撕去表皮 A 将暴露的花肉组织浸泡在酶液里。

13、 B 排列相对疏松的花肉细胞很容易被酶液消化。 在酶液消化过程中，由于实验材料的个体差异，酶解时间不固定。因此要用显微镜随时检查酶解情况,例三 植物原生质体的培养,酶解好的原生质体经300目尼龙网过滤到离心管中，除去未消化的大块组织,例三 植物原生质体的培养,1000rpm离心5分钟,使原生质沉淀，弃上清，加培养液吹打悬浮，再离心洗去酶液，并悬浮在培养基中,置光照培养箱中培养,例三 植物原生质体的培养,显微镜下观察、计数， 加适宜体积的培养基， 分装到细胞瓶中，置培养箱中培养,例三 植物原生质体的培养,3 细胞传代方法和步驟： 细胞培养34天后，将培养液吸掉，加入PBS缓冲液洗细胞表面，再将P

14、BS完全吸掉。 加入Trypsin-EDTA，置37数分钟，使单层细胞从瓶面脱落。 加入培养液冲洗细胞，在4下，以4,000rpm离心1分钟。 弃上清液，再将细胞悬浮移至内含培养液的培养瓶中，于37培养,一、 细胞培养技术 （四）方法与步骤,一、 细胞培养技术 （四）方法与步骤,4. 细胞的保存与复苏A 液氮中长期保存的方法步骤： 取培养2天的细胞，加Trypsin-EDTA使细胞胞悬浮在培养液中再离心。 弃上清液，加保存液(90%培养基+10%DMS0)悬浮； 分装保存管中，再移至液氮罐内保存。B 低温中短期保存：C 液氮中保存细胞的复苏 从液氮罐中取出细胞，迅速置37水浴中解冻。 4下以4

15、000 rpm离心20秒，弃上层含DMSO的培养液。 将细胞悬于培养液(DMEM+5%FCS)中，移至培养瓶，37培养,通过动物细胞培养，生产具有重要医用价值的疫苗、单抗酶、生长因子等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。 众多研究焦中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品产率和质量。 问题 1 细胞培养中氨离子、乳酸、的积累 细胞死亡与凋亡 培养基与细胞系 细胞大规模培养过程监控,一、 细胞培养技术 （五）问题与讨论,B细胞浆细胞分泌抗体；单一B细胞有其专有抗体(单抗,McAb,二、 单克隆抗体制备技术 （一）原理与概念,1975年， 英国剑桥大学学者Kohler 和Milstein将小

16、鼠骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫后的小鼠脾细胞进行融合，形成既能产生抗绵羊红细胞抗体、又能进行分裂繁殖的杂交瘤细胞，创立了杂交瘤抗体技术，获1984年Nobel奖。 1984年通过基因工程技术，初次建立了人-鼠杂交瘤。 1987年单抗制剂开始用于临床试验。 单抗技术，解决了抗体不纯的问题，标志着抗体制备从机体水平进入了细胞水平。由此而建立的单链抗体库技术和噬菌体抗体库技术等，则使抗体制备技术迈进分子水平,二、 单克隆抗体制备技术 （一）原理与概念,单克隆抗体制备技术： 将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，建立能分泌均质抗体的杂交瘤细胞系的生物技术。也称为杂交瘤技术,二、 单克隆抗体制备技术 （一）原理

17、与概念,杂交瘤技术的关键是如何筛选杂交瘤细胞， 使用HAT选择性培养基解决了此技术问题。 HAT： H (hypoxanthin)次黄嘌呤 A (aminopterin)氨基喋呤（正常细胞DNA合成的阻断剂） T (thymidine)胸腺嘧啶（供旁路途径利用,二、 单克隆抗体制备技术 （一）原理与概念,正常细胞嘌呤和嘧啶的生物合成途径可被氨基喋呤阻断. 但细胞在提供了胸腺嘧啶和次黄嘌呤的情况下，依赖胸腺激酶(TK)和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT)可合成DNA,SP2/0 细胞 是由有毒药物(如8氮杂鸟嘌呤或5溴脱氧鸟嘧啶核苷)诱导而选择产生的代谢缺陷型小鼠骨髓瘤细胞，胞内无TK或HG

18、PRT酶，因此在HAT选择培养基中会死亡。 在与具有TK和HGPRT酶的脾细胞融合后，形成的杂交瘤细胞获得了这些酶，因此在HAT培养液中能存在并生长繁殖,二、 单克隆抗体制备技术 （一）原理与概念,二、 单克隆抗体制备技术 （二）实验前的准备,1). 器皿试剂 器皿、培养基必须预处理、严格无菌； 水源: 必须采用无离子水，电导率大（10-6以上）。 培养基：DMEM、RP1640，L-谷氨酰胺、 小牛和胎牛血清，8-氮杂鸟嘌呤，HAT，HT。 试剂：双抗，7.5%NaHCO3，PEG100010000，DMSO等 羊抗鼠Ab、荧光素、碱性磷酸酶、过氧化物酶标记物 兔抗鼠IgG，IgA，IgM，

19、轻链、等亚级分子,二、 单克隆抗体制备技术 （二）实验前的准备,2). 抗原制备 抗原越纯、活性越高，就越好。 （1）病毒抗原：培养物、病料均要分离纯化病毒。 （2）细菌抗原： 先进行克隆纯化、鉴定，批量冻存确保菌株的可靠性 在对数生长期收获菌体， 对菌体进行灭活。 （3）寄生虫、原虫抗原： 虫体大，抗原复杂，要对虫体成分进行必要纯化,二、 单克隆抗体制备技术 （二）实验前的准备,4）常规免疫： 免疫剂量：纯抗原10-50ug/mouse，粗抗原100-200ug/mouse 佐剂：完全费氏佐剂或不完全费氏佐剂与免疫源等量混合乳化 免疫程序：首免加完全佐剂，腹注量在0.5ml以内。5）非手术脾

20、内免疫： 免疫剂量：10-50ug/mouse，0.05ml， 免疫方法：细胞融合前35天进行。 刮毛，消毒，见鼠脾位于腹左侧，30度斜角将抗原(少于0.1ml)注入。 三免可用脾内免疫代之,经抗原免疫的小鼠 代谢缺陷型小鼠骨髓瘤细胞的培养 收集致敏的小鼠B淋巴细胞 收集培养的细胞 在PEG作用下进行细胞融合 用HAT培养基筛选杂交细胞 用免疫学方法筛选可分泌特异抗体的杂交细胞 杂交细胞的克隆化培养 再检测、再克隆（重复23次，至100的杂交瘤生长孔阳性为止） 阳性克隆的扩增和冻存 杂交瘤细胞的染色体分析 收集阳性克隆培养上清液进行单克隆抗体性状鉴定 单克隆抗体的生产和纯化,二、 单克隆抗体制

21、备技术 （三）单抗制备流程图,二、 单克隆抗体制备技术 （四）杂交融合,1. SP2/0细胞的复苏： 2. 免疫小鼠的准备： 3. Balb/c小鼠免疫脾细胞的制备： (1) 颈动脉放血 (2) 取出脾脏 (3) 挤出脾细胞并用DMEM培养基悬浮之 (4) 离心并松弛细胞团 (5) 氯化铵低渗，去除红细胞 (6) SP2/0细胞离心、重悬在10ml DMEM中备用 (7) 将经氯化铵低渗，去除红细胞的鼠脾细胞悬浮在DMEM培养基中 (8) 细胞计数,二、 单克隆抗体制备技术 （四）杂交融合,4. 细胞融合： (1) SP2/0细胞和免疫脾细胞按1:2至5例混合，混匀，离心并悬浮细胞团。 (2)

22、 缓慢加入细胞融合剂（PEG），同时不断地旋转离心瓶。 (3) 离心，弃上清，松弛细胞团。 将细胞重悬在15牛血清和HAT的全价选择培养基。 (4) 按每毫升105 SP2/0细胞中做进一步稀释，并移到一无菌的加样槽中， 用8孔微量移液器，将细胞分装到96孔培养板中，每孔0.1ml (5) 58CO2中培养到第五天， 每孔加0.1ml新鲜的HAT培养液，继续培养五天,二、 单克隆抗体制备技术 （四）杂交融合,5. 检测分析： （1）于第812天观察杂交瘤细胞生长情况， 杂交瘤细胞长至孔底1/2或培养基颜色偏黄时，在细胞板上做好标记 (2) 分别将待检的上清移到无菌处理的旧板内， 每孔取0.1m

23、l，然后进行抗体活性测定 (3) 第二批及第三批长大的细胞，按上述方法分批检测， 对有杂交瘤细胞生长细胞孔，生长时间超过12天的进行半量更液。 (4) 当用于检测的上清移走后，马上加入等量新鲜的HT培养基,二、 单克隆抗体制备技术 （五）杂交瘤细胞扩大培养与特异性分析,1 阳性杂交瘤细胞的扩大培养：2、阳性杂交瘤细胞的特异性分析：3、细胞克隆： (1)有限稀释法克隆： (2)、软琼脂培养法克隆： (3)、甲基纤维素分离法：4、单抗的生产 (1). 用组织培养的方法。 (2). 用接种动物体内繁殖法生产单抗。 有报道显示(2)比(1)的单抗含量要高1000倍,二、 单克隆抗体制备技术 （六）杂交瘤细胞的冻存与复苏,1、冻存： 1）离心收集混悬细胞 2）加入冻存剂混匀后置液氮中保藏 3）短期冻存(2-3个月)，-80冰箱直接保存2、复苏： （方法已介绍,二、 单克隆抗体制备技术 （七）单抗研究进展及其应用,单抗制备技术的改进： 选择弱免疫原载体， 采用脾内免疫、腹腔植入、淋巴结注射和足垫注射， 使用EB病毒、仙台病毒、PEG、电和激光等介导细胞融合， 用细菌、噬菌体等构建组合抗体文库，快速、大量生产抗体， 在基因水