实验 植物DNA提取及检测

1、植物总dna的提取及琼脂糖凝胶电泳检测,植物基因组 dna的提取 琼脂糖凝胶电泳检测,一 、实验目的,学习提取和纯化高等植物总dna的方法，理解其原理,脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna) 与蛋白质结合在一起以核蛋白（dnp）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。 植物总dna包括细胞核dna和细胞核外dna,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体dna(mtdna)和叶绿体dna(ctdna,二、实验原理,细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸,基本过程,机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用sds处理细

2、胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁,细胞破碎,sds法 sds是有效的阴离子去垢剂, 细胞中dna与蛋白质之间 常借静电引力或配位键结合, sds能够破坏这种价键。 ctab法 ctab是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的dna-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使dna与蛋白质分离,dna提取,蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 rna 常选用rnase消化 ，或是用licl来消除大分子的rna。 酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料,dna纯化（去杂质,实验材料 植物叶片(去叶脉) 试剂 2ctab抽提

3、液（ctab、tris-hcl、edta、nacl） te 缓冲液(ph=8.0) 氯仿：异戊醇(24:1) 巯基乙醇 异丙醇 70%乙醇,三、材料与试剂,离心机 水浴锅 研钵 微量移液器,仪器用具,移液器量程的选择,1取 2g 清洗凉干的植物幼嫩叶片于研钵中，加 入液氮，迅速研磨。将2ctab抽提液与2ml巯基乙醇在提取前混合后于65水浴中加热30分钟。 2将 0.5ml 研磨液转入 1.5ml 离心管中，加入1ml ctab提取液，置于65水浴中保温 30min，其间颠倒混匀23次。破碎细胞 3. 加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒混匀20分钟，防止成团。8000r/min

4、，离心 5min，取上清。抽提去蛋白 4将上清液移入新的1.5ml离心管内，加 等体积异丙醇（预冷）。颠倒混匀，可见 dna 絮状沉淀。沉淀核酸 58000r/min，离心 1min，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。 将沉淀回溶于无菌水或 te 缓冲液待测,四、操作步骤,1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 ctab 抽提液充分混匀； 2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（25），尽可能选取幼嫩的材料； 3）收集 ctab 与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解难； 4）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免

5、过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解,五、注意事项,六、作业,为了获得高质量的植物总dna，在分离提取过程中应注意那些问题,琼脂糖凝胶电泳检测dna,一、实验目的 学习琼脂糖凝胶电泳检测dna的方法和技术,dna分子在高于等电点的ph溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，dna分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比,二、实验原理,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强,三、实验仪器和试剂,仪器 电泳仪 电泳槽 灌胶模具等,tris-硼酸（tbe） tris-乙酸（tae） tris-磷酸（tpe,常用电泳缓冲液,电泳指示

6、剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。 作用： 增加样品比重，以确保dna均匀沉入加样孔内。 形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 使样品呈色，使加样操作更方便,上样缓冲液,溴化乙锭（eb） 是一种荧光染料，eb分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与dna的含量成正比。据此可粗略估计样品dna浓度。琼脂糖凝胶eb染色，肉眼可见核酸电泳带，其dna量一般5ng。 eb是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 goldviewtm: 是一种可代替溴化乙锭（eb）的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测dna时，goldviewtm与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与eb相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链dna呈现绿色荧光，而单链dna呈红色荧光。goldview不仅能染dna，也可用于染rna,核酸染色剂,dna分子量标准,不同种类dna marker,1.凝胶制备 制备1%琼脂糖凝胶。称取0.8g琼脂糖加入 80ml 1tae，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60 时，加入 eb或goldviewtm 10ul。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。 2.加样 取15l dna样液与 2l 上样 buffeer 混匀，用微量移液器小心加入样品槽。 3