代谢组学技术及其在中西医结合研究中的应用展望

1、 代谢组学技术及其在中西医结合研究中的应用展望 作者：吴斌, 严诗楷, 沈自尹, 张卫东 【关键词】 代谢组学; 中西医结合; 医学; 综述 代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一种研究生物系统的组学方法。它是英国Nicholson教授及其同事于1999年正式提出的1。代谢组指的是“一个细胞、组织或器官中，所有代谢组分的集合，尤其指小分子物质”，而代谢组学则是一门“在新陈代谢的动态过程中，系统研究代谢产物的变化规律，揭示机体生命活动代谢本质”的科学2，它所关注的是相对分子质量为1 000以下的小分子。近年来代谢组研究已引起众多研究者的注意，代谢组学与基因组学和蛋白质组学不同，基因组学

2、和蛋白质组学告诉你可能发生什么，而代谢组学则告诉你已经发生了什么；还有研究者认为代谢组学是“组学”研究的终端3。为更好地将代谢组技术应用于中西医结合研究中，本文根据近年来国外的相关资料，对代谢组学的实验技术、分析技术及其在现代医学中的应用现状进行了综述，同时对代谢组学在中西医结合研究中的发展趋势进行了展望。 1 代谢组学的实验技术 代谢组学研究的常用技术 代谢组学研究常用核磁共振和质谱联用技术，比如气相色谱质谱联用仪和液相色谱质谱联用仪等4。核磁共振光谱分析法是目前代谢组学研究应用最广泛的方法，NMR的优势在于对样品无破坏性，样品处理简单，无需分离过程；缺点是灵敏度低，很难同时测定生物体系中共

3、存的浓度相差较大的代谢产物，所需硬件的投资也较大。目前常用的是1DNMR，比如Brindle等5应用NMR研究高血压患者血清的代谢谱特征；Lehnhardt等6应用NMR研究原发性和继发性脑肿瘤的代谢谱差异等。1DNMR光谱的信息量大，但不可避免地存在峰图的重叠，影响了随后的分析，而2DNMR大大地改善了1DNMR峰图的质量7，一些研究者开始应用2DNMR开展代谢组研究，如Choi等8为了研究被烟草花叶病毒感染烟草的代谢谱变化，应用2DNMR方法，结果发现5绿原酸等代谢物明显增多。气相色谱质谱联用是当前最为活跃的联用技术，一般供试物经GC分离为单一组分，按其不同保留时间，与载气同时流出色谱柱，

4、再经接口，进入质谱仪，然后可通过EI或其他方法产生一定的MS图谱。GCMS有很好的分离效率，可由计算机对MS图谱进行化合物数据库的自动检索核对，有利于迅速鉴识样品。缺点是需要对样品进行衍生化预处理，这一步骤额外费时，甚至引起样品的变化；衍生化预处理限制了GCMS的应用范围，无法分析热不稳定性的物质和分子量较大的代谢产物。如A等9针对GCMS的代谢组研究，应用多元统计方法对人血浆的提取和衍生化预处理方法进行了研究。液相色谱质谱联用主要是高效液相色谱质谱方法，比较肝炎、肝硬化与肝癌病人的尿液代谢谱的差异，结果发现一组尿代谢物与肝癌的相关性优于传统单一的甲胎蛋白。无论NMR、色谱和质谱都有各自的优缺

5、点，为了充分发挥各种技术的优势，有研究者将三种技术联合应用于代谢组的研究。如Lenz等12应用1HNMR和HPLCTOFMSMS技术相结合研究庆大霉素的肾毒性尿液的内源性的代谢物变化，结果发现葡萄糖增加，三甲胺N氧化物降低等变化特点。 代谢组学研究的新技术 微量样本是研究中经常面对的难题，而毛细管电泳质谱所需样品量少，已广泛地应用于代谢组的研究中，如Sato等13选择了CEMS进行了水稻叶的代谢物检测，成功地检测了88种代谢物，这些代谢物涉及到醣酵解、三羧酸循环、磷酸戊糖途径、光呼吸作用和氨基酸的生物合成等。近年来为了监测活体动物特定组织区域内代谢物的动态变化，研究者将微透析技术引入了代谢组的

6、研究，如Price等14应用微透析结合NMR比较了SD大鼠各组织在局部缺血状态下的代谢情况。作者提出微量渗析技术和NMR相结合是代谢组研究的强有力工具。可见代谢组同其他实验技术一样，有一个不断完善的过程，一些研究者正致力于代谢组实验技术的研究。 代谢组的研究材料 代谢组研究的样本包括生物液体和组织，由于血浆和尿液收集简单、易于长期检测和包含大量的代谢信息，已经成为代谢组研究常用的标本；唾液也逐渐成为代谢组研究的另一种生物液体样本，如Ramadan等15选择了150个健康男性和女性，取唾液、血浆和尿液，应用1HNMR研究不同性别之间的代谢物差异等。此外还有应用脑脊液进行代谢组研究的报道，如Coe

7、n等16应用NMR研究细菌、真菌、病毒性脑膜炎脑脊液的代谢组变化，进行脑膜炎的代谢组临床诊断的探索研究。血浆或尿液代谢物为全身各细胞、组织、器官代谢的分泌物，但是血浆或尿液只能代表生物体的平均代谢状态或代谢组“整体模式”，不能获得具体组织的代谢状态。组织代谢研究提供了局部的代谢信息，而一些疾病本身可能就只影响了局部的代谢，如Viant等17研究早期脑外伤动物模型大脑组织与血浆的代谢物变化，结果在大脑组织有氧化应激兴奋性中毒等代谢紊乱，而血浆中并没有发现明显的变化，因此组织代谢的研究具有重要的意义。目前组织标本研究还不是很多，主要有肝、大脑皮层和小脑等，肝组织主要用于一些毒理学研究，如Azmi等

8、18应用NMR技术，采集肝组织样本研究肝毒性的代谢组变化等。大脑皮层、小脑组织主要用于神经系统疾病的研究，如Griffin等19应用NMR研究脊髓小脑性共济失调动物模型小脑、大脑的提取物的代谢谱变化，结果发现谷氨酰胺增加，而氨基丁酸、胆碱、磷酸胆碱和乳酸盐下降等特征。 代谢组研究的影响因素 充分了解代谢组研究的影响因素是应用好代谢组技术开展医学研究的前提，目前研究者们已经注意到了代谢组研究的影响因素20，除了实验技术本身对代谢组研究的影响外，还有如样品制备、仪器性能和数据分析方法等。不同生理状态对代谢组的影响也引起了研究者的重视，比如性别、年龄、饮食、昼夜变化、文化等，因为这是代谢组技术在临床

9、应用的关键问题21。如Stanley22等为了探索不同性别间的代谢物差异，选择了NMR结合化学计量方法研究不同性别Wistar大鼠尿液的代谢谱，结果发现羟苯基丙酸等代谢物存在明显的性别差异；Kochhar等23选择了150名健康人，应用NMR方法研究不同性别人血清和尿液的代谢谱差异，结果发现女性脂类的合成高于男性，男性的蛋白质转换多于女性等差异。Bollard等24还综述了不同生理状态下的动物尿的代谢物特征，尤其在不同个体之间、性别、年龄、饮食、物种、品系、激素状态、压力及昼夜变化等，发现不同的生理状态对代谢组有明显的影响。Lenz等25收集了给予标准饮食的12名健康男性相隔14 d的血浆和尿

10、液进行NMR检测，应用PCA进行数据分析，结果发现血浆的差异很小，但在尿液中存在很大的个体差异，同时发现所有受试者代谢1234下一页 谱存在昼夜变化规律。Lenz等26还比较了不同国家之间人群的代谢谱的差异情况，选择单身的受试者，不进行饮食限制，收集晨尿，应用NMR进行分析，使用PCA分析数据，结果发现一些有统计学意义的差异，研究表明内源性尿代谢谱受到文化、饮食的严重影响，因此在疾病或治疗标志物的筛选中需要特别注意这些影响因素，此外还需结合数学的方法以排除这些影响因素。 2 代谢组的分析技术 谱峰的预处理 谱峰的预处理对代谢组的后期分析有较大的影响，质谱峰的预处理包括背景扣除、滤噪、保留时间校

11、正、谱峰匹配和归一化或标准化等。NMR谱峰的预处理包括背景扣除、滤噪、归一化或标准化等。一些学者正对谱峰预处理的方法进行研究，比如针对1HNMR原始光谱资料，Stoyanova等27介绍了一种基于时间窗口的自动校正谱峰的方法；WebbRobertson等28就对谱峰整合和归一化方法进行了研究。此外样品的分析过程中不可避免地会出现谱峰漂移，Forshed等29比较了bucketing和PLF两种最近发展的NMR峰位校正法，并应用实例对两种方法进行了比较。气或液质联用技术，通过常规的重叠峰析法后，能分离300多种代谢物，但该方法耗时而且不能自动化。Jonsson等30发展了一种半自动的逐级多元曲线

12、分辨处理质谱数据的方法，该方法已经应用于不同发育时间植物叶的代谢物研究，结果表明该法和常规的重叠峰析法具有类似的可信度。还有研究者开发谱峰的预处理软件，比如Katajamaa等31针对LCMS开发了MZmine软件，该软件主要用于代谢组资料的滤噪、谱峰匹配和标准化等预处理。 数据分析 医学中的代谢组研究常常需要对疾病机制或治疗相关的代谢标志物进行研究，常用的分析方法有PCA、t检验和方差分析等。如Coen等32应用PCA方法对乙酰氨基酚肝毒性的代谢组资料进行分析，结果发现该肝毒性可能与肝脏线粒体利用丙酮酸盐和脂肪酸氧化功能下降有关；Jansen等33还介绍了一种权重PCA方法处理代谢组资料；S

13、milde等34提出了一种基于方差分析的同时成分分析方法处理代谢组数据。在疾病的诊断研究方面常常应用判别分析，比如应用代谢组资料对患者进行某病的是与否判别等。常用的方法有类模拟软独立建模、偏最小二乘法判别分析和人工神经元网络等，比如Odunsi等35使用1HNMR研究上皮卵巢癌。选择38名上皮卵巢癌病人，12名良性卵巢囊肿和53名健康妇女，应用PCA方法降维数据和SIMCA方法进行模式识别，结果分析判断的准确率为97%。Wang等36应用LCMS技术研究2型糖尿病的血浆代谢谱，应用PCA和偏最小二乘法显著性分析方法能成功地将糖尿病人和对照正常人区分开来，为临床诊断提供了参考。Bundy等37选

14、择了6种蜡样芽胞杆菌，其中3种为实验室使用的无毒的菌株，另3种为从脑膜炎患者分离的有毒的菌株，应用核磁共振方法进行代谢组学研究，采用主成分分析和权威的判别分析方法，结果发现判别分析能正确地将有毒、无毒菌株分开。Taylor等38使用433种代谢物资料，应用人工神经网络的方法建立数学模型，该模型能成功地对植物的基因型进行判别分析。 3 代谢组技术在现代医学研究中的应用 在疾病机制研究中的应用 目前代谢组在疾病机制研究中的应用还不多，主要应用于肿瘤、遗传病和少数几种常见病之中。如Akira等39应用NMR研究高血压大鼠与正常大鼠尿的代谢谱差异，应用PCA的方法进行分析，结果发现牛磺酸、肌酸及一些未

15、鉴定的代谢物存在明显的差异。Pears等40应用NMR结合统计学的模式识别方法，研究Cln3基因敲除的巴藤病小鼠动物模型脑组织的代谢组变化，结果发现谷氨酸含量增加、氨基丁酸下降，提示在谷氨酸/谷酰胺与GABA之间存在神经递质循环的不足，这些变化代表了Cln3小鼠表型出现前的生化变化。Ippolito等41为了研究预后不良前列腺癌的特征，首先分析原发性前列腺癌及细胞株的基因表达谱资料，获得446条高表达的基因，应用这些基因结合代谢组学研究前列腺癌的代谢途径，结果发现预后不良前列腺癌存在谷氨酸脱羧酶等一些特征性代谢途径。为了更好地应用代谢组资料进行疾病的机制研究，一些研究者将代谢组技术和其他技术相

16、结合进行疾病机制的探索研究，如Stentiford等42应用代谢组结合蛋白质组和组织病理学方法研究肝癌的发病机制等。 在疾病诊断中的应用 由于代谢组监测是一种快速和无损伤的方法，在疾病诊断方面的研究开展相对较多，如Brindle等43应用NMR技术研究冠心病患者血清的代谢组变化，PLSDA模式识别方法不仅能对冠心病进行有无的诊断，而且还能判断病情的轻重。Yang等44以毛细管气相色谱结合模式识别方法研究2型糖尿病血清代谢组的变化，结果发现血清脂肪酸谱能有效地将2型糖尿病和正常人区分开，模式识别方法提高了诊断的敏感性。Wishart45还将代谢组方法应用于器官移植中监测排斥反应，在器官移植前后监

17、测血清肌酸酐的代谢产物，认为代谢组可能成为器官移植生存能力和排斥反应的理想监测工具。最近代谢组学技术还应用于艾滋病的研究中，如Hewer等46应用1HNMR检测患者血清的代谢谱，结合模式识别方法，发现血清的代谢谱能够将艾滋病阳性和阴性的患者区分开来。随着研究的深入，代谢组技术必将应用于更多的疾病研究之中。 在药理学研究中的应用 代谢组在药理学方面的研究，主要集中于毒理学研究，如Kleno等47为了研究肼苯哒嗪诱导的肝毒性，选择肝脏样本，应用NMR技术研究血清样本代谢谱，结果发现肼苯哒嗪引起了代谢物的明显变化，主要与葡萄糖、脂肪、氧化应激代谢相关。Heijne等48将溴苯诱导的肝炎大鼠血浆和尿液

18、的代谢组资料结合大鼠的肝脏的基因表达谱资料分析，结果发现转录组和代谢组结合能提高肝毒性检测的敏感性。Coen等49为了鉴定扑热息痛肝毒性引起的生化变化，进行了肝组织的基因表达谱和肝组织及其提取物和血浆代谢组研究，从生化途径对3种资料进行分析，在完整肝组织中，肝葡萄糖和肝糖原下降，血浆中的脂肪成分丙酮酸盐、醋酸盐、乳酸盐增加，水提物中丙氨酸、乳酸盐增加。整合这些资料提示肝脏的糖酵解率增加，代谢组研究结果和基因表达谱的变化是一致的，主要涉及脂肪和能量代谢，两种技术相结合起到互补的作用。 4 代谢组学在中西医结合研究中的应用展望 由于代谢组技术的一些优势和特点，目前代谢组已在现代医学中开展了一些研究

19、，并取得了一系列的成绩。因此中西医结合也应积极应用代谢组技术开展证候、方药及针灸等方面的研究。2017和2017年度国家自然科学基金开始对该方向进行了资助，主要集中在肾虚、肾阳虚、脾虚及虚实证等少数几个项目。目前中医药应用代谢组技术研究的报道还极少，相信随着研究的深入，代谢组技术必将广泛地应用于中西医结合研究中。另外，尽管代谢组是一种高通量的研究方法，但是由于代谢组关注的是小分子的代谢物，所以如果缺乏与基因组等知识的联系，代谢组资料是很难解释的。将代谢组与基因组和蛋白质组进行结合研究也引起众多学者的注意50, 51，因此中西医结合也应积极地将代谢组与基因组和蛋白质组进行结合研究，即站在系统生物

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