1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验(最新整理)

1、第一天1、配置 lb 培养基：酵母粉 15g、胰蛋白胨 30g、氯化钠 30g，定容至 3000ml。调节 ph 至7.4（2mnaoh），高压蒸汽灭菌 20 分钟，37保存。分装成 15 瓶（每瓶200ml）。2、接种（超净台要提前杀菌通风）取 4 瓶上述培养基，每瓶加 200lamp（1:1000）、60l 菌液。37过夜。第二天1、扩大培养（超净台）4 瓶扩至 16 瓶，每瓶培养基加 200lamp，摇床培养 1 小时左右。2、诱导（超净台）加 40liptg，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25摇床培养 4 小时。3、离心获取菌体4，8000rpm 离心 25 分钟。注意配平。4、

2、超声波破碎菌体离心后去上清，向沉淀加入（600mlpb 裂解液、300l 溶菌酶、3mlpmsf）。将菌液转入 2 个烧杯中，冰浴超声波破菌，400w，75 次，每次 6 秒，间隔 2秒。离心收集上清液。600mlpb 裂解液：20mm/l pb，10mm/l edta，5%甘油，1mm/l dtt， 调节 ph 至 7.4。超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。5、抽滤（双层滤纸)洗胶（gst）。将上述上清液抽滤，滤液与 gst 胶混合，磁力搅拌过

3、夜。第三天1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样 20l，留电泳。2、洗杂蛋白，用 1pbs+pmsf(1000:1)约 400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。3、洗脱目的蛋白，洗脱液加 50ml，分 3 次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱 15 分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样 20l，留电泳。用洗脱液调零，测 od280。（od 值达到 1.5 为佳）4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于 2l 透析液 1中，加入磁珠置于 4冰箱内磁力搅拌器上，4 小时后换为透析液 2。胶的回收： 用 3m 氯化钠溶液（用

4、1pbs 溶液溶解）、1pbs（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。洗脱液：50mm/ltris-hcl 、10mm/lgsh透析液 1：20mm/l tris-hcl、 1mm/l edta 、 0.15mm/l dtt透析液 2：:0.5mm/l edta、1pbs“”“”at the end, xiao bian gives you a passage. minand once said, people who learn to learn are very happy people. in every wonderful life, learning is an eternal the

5、me. as a professional clerical and teaching position, i understand the importance of continuous learning, life is diligent, nothing can be gained, only continuous learning can achieve better self. only by constantly learning and mastering the latest relevant knowledge, can employees from all walks of life keep up with the pace of enterprise development and innovate to meet the needs of the market. this document is also edited by my studio professional