肿瘤分子检测与质量控制课件

1、深圳市人民医院病理科 分子实验室 姜阳阳 2015-10-27,肿瘤分子检测方法与质量控制,医学发展历程的启示,经验医学,循证医学,精准医学,诊断靠治疗后期经验积累,诊断治疗以人群、科学研究证据指导临床实践,诊断治疗以个体为基础，更加提前、具体与精确,分子时代,肺腺癌：EGFRKRASBRAFALK-ROS1RET等检测已是共识； 肺鳞癌发生模式不同，检测靶标以扩增为主，同时EGFR、ALKROS1某些病例也有必要检测,我们可以用的分子生物学手段,实时荧光PCR方法（扩增阻碍突变系统法（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）、PCR-高分辨

2、溶点曲线分析（HRM）、数字PCR等） PCR-杂交法（膜上、芯片基因芯片 、乳胶颗粒Luminex） PCR-Sanger测序 PCR-焦磷酸测序 新一代高通量测序 PCR-SSCP、RFLP、dHPLC等 荧光原位杂交（FISH） 直接杂交 免疫组化,分子病理检测的主要方法,检测技术,检测对象,检测基因,检测水平,EGFR，KRAS，BRAF， BRCA, BCR-ABL，JAK2,EML4-ALK，ROS1，HER2， RET,BRCA1，TOP2A，TYMS,EGFR，EML4-ALK， HER2,是RT-PCR平台上的特异扩增技术（易开展） 共发表300多篇文献 著名的大型临床研究

3、- 如IPASS、INFORM等,国际肺癌协会专家共识中国基因突变检测专家共识日本临床专家共识,ARMS技术被临床证明的肿瘤基因突变检测技术,DNA 基因重排,融合mRNA或5/3 mRNA差异表达,嵌合蛋白表达,肺癌中ALK基因变异的表达调控,FISH/CISH NGS,RT-PCR 5/3比较qRT-PCR RACE-PCR,IHC,荧光原位杂交技术（FISH,2个信号分离直径的要求，使实际应用中结果难以判断 有5-11%出现假阳性信号分离1，2，3 工作强度大，费时 主观性强，受人为因素影响大,横向,纵向,1. FISH技术是美国药物临床试验中所采用的检测方法。 2. 采用“分离”分析，

4、基因倒位和ALK重排后，红色和绿色探针分开 3. 15%的样本细胞中呈现分开的红色和绿色信号表示阳性结果1,操作简单，时间短 结果客观，易于判读，减少人为因素的影响 除FFPE样本外，还适用其他类型样本组织1 与EGFR、RET、ROS1等其他检测不冲突，共用相同组织切片和PCR扩增程序，节约有限资源和时间 中国荧光PCR仪器普及率更高，更加适合国情,实时逆转录法（Real Time-PCR,CFDA批准的基因检测产品,基于Real Time-PCR方法检测驱动基因的分子诊断产品获得CFDA批准最多,2-3 片FFPE样品 同时将DNA和RNA分离出来 同时获得EGFR、ALK和ROS1检测结

5、果,节约样本、节约时间、节约成本,DNA/RNA,EGFR突变型,ALK阳性 或ROS1阳性,EGFR野生型 ALK阴性 ROS1阴性,吉非替尼 厄洛替尼 埃克替尼 阿法替尼,克唑替尼 色瑞替尼,其他治疗方式,DNA/RNA共分离剂盒,EGFR/ALK+ROS1,2.5小时PCR,4.5小时,FFPE切片1-3片 或活检小标本,2015 NSCLC NCCN指南,对于NSCLC患者建议检测EGFR和ALK基因状态； 对于ROS1/MET/RET/BRAF/ HER2等崭露头角的靶基因也给予关注,1.室内质量控制 2.室间质量评价,分子病理实验室的质量控制,1.建立标准化的实验室 2.具备资质且

6、相对固定的人员 3.性能稳定的试剂 4.持续不断的学习和开展质控,医疗机构临床基因扩增检验室管理办法（卫办医政发2010194号） 医疗机构临床基因扩展检验实验室工作导则（卫办医政发2010194号,FISH实验区,临床基因扩增实验室 标准化操作文件（sop,1.写你所做 2.做你所写 3.实验室的精髓,可操作性的sop文件,人员资质,理想的试剂,试剂方法的性能验证及每批试剂的质检 性能指标： 重复性（精密度） 准确性（定量：回收率、标准物质等；定性：方法学比较等） 线性范围（定量） 分析特异性 测定下限 抗干扰能力,资质认证 试剂质量 试剂反应性能 前后批号结果一致性 测定下限 批内变异（10%)和批间变异（15-25,你其实做了这些，但是你有记录么,1.日常维护 2.定期保养 3.维修记录,实验室最忠实的员工-仪器,全流程：标本接收-石蜡切片-核酸提纯-实时荧光定量PCR扩增-结果分析 分析前：标本接收、制片、填写检测申请单 分析中：核酸提取、扩增、产物分析、检测有效性判断 分析后：结果分析、报告审核、结果解释 标准：重复，可控，规范,全流程室内质控,DNA模板质量更重要，建议对提取的DNA模板进行质量检测： OD260/OD280=1.80.2， OD260/OD2301.7,全流程