靶器官毒理学第十三章免疫毒理学

1、1,靶器官毒理学,免疫毒理学 生殖毒理学 神经毒理学,第十三章 免疫毒理学,3,1，青霉素导致过敏性休克 2，利用动物实验和人类流行病学的数据资料得到的最新的研究结果显示，若臭氧浓度下降10%，非恶性皮肤瘤的发病率将会增加26,问题,4,内涵： 外源化合物和/或其代谢物直接或间接作用于免疫系统 免疫系统对外源性化学物和/或其代谢物产生的免疫应答 外源化学物和/或其代谢物改变机体抗原,免疫毒理学是研究外源化学物和物理因素等对机体免疫系统的损害作用、 生物学机制及其危险度评价与管理，是在免疫学和毒理学基础上发展起来的 一门毒理学分支学科,生物性因素,5,免疫毒理学概述 免疫系统的毒性反应与机制（*

2、） 免疫毒性试验方法与评价（*） 免疫毒性检验方案,主要内容,6,免疫生物学基础概述,一，免疫系统的组成及其功能 （一）免疫器官和组织 （二）免疫细胞 （三）免疫分子 二，免疫应答过程及其病理反应 （一）免疫应答的三个阶段 （二）免疫应答的病理反应,7,免疫器官和组织、 免疫细胞 及免疫分子,识别自己和非己抗原， 对自身耐受，清除非己， 表现为免疫防御、免疫自稳 和免疫监视三大功能,一、免疫系统的组成及其功能,8,中枢免疫器官： 包括骨髓和胸腺，是造血干细胞分化为B 细胞和T细胞的场所,周围免疫器官：包括脾、淋巴结、淋巴小结及全身弥散的淋巴组织。他们是成熟的T细胞和B细胞定居及对抗原应答的场所

3、,免疫器官和组织,9,T细胞和B细胞发育分化过程示意图,10,免疫细胞,一，免疫活性细胞：（immunoconpetent cell, ICC) 指能识别特异抗原以及受抗原刺激后向母细胞转化、分裂增殖并分化为能产生免疫效应物质 (如抗体、淋巴因子)的淋巴细胞, 包括T淋巴细胞和B淋巴细胞。 二，辅佐细胞： 辅佐细胞（accessory cell，简称A细胞）在免疫应答中的主要作用是呈递抗原，故又称抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC），主要有：树突细胞（dendritic cell，DC） 、单核细胞和巨噬细胞。 三，其他免疫细胞：NK细胞，单核吞噬系统等,11

4、,主要包括： 抗体：是机体在抗原物质刺激下，产生的一类具有与该抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白（inununoglobulin, Ig)。它主要存在于动物的血液、淋巴液、黏膜分泌物和组织液中，是构成机体体液免疫的主要物质。 补体：是正常人和动物血清中存在的一组具有酶活性的、不稳定的、无抗体活性的、但能帮助抗体溶解靶细胞的血清球蛋白，称补体系统。 细胞因子：由活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的、介导和调节免疫应答及炎症反应的小分子蛋白类因子非特异性免疫效应物质。 HLA分子：人类白细胞抗原,免疫分子,12,免疫应答(immune response) 是机体非特异性和特异性的识别并排除异己成分以

5、维持自身稳定的全过程，因而免疫应答是整个免疫学的核心。 非特异性免疫应答主要指吞噬作用和炎症反应； 特异性免疫应答是指细胞免疫应答和体液免疫应答。 抗原刺激T细胞与B细胞产生致敏T细胞和(或)抗体称正应答； 未产生致敏T细胞或抗体的负应答即耐受,二、免疫应答过程及其病理反应,概念,13,T细胞受到抗原刺激后，增殖、分化、转化为致敏T细胞(也叫效应T细胞)，当相同抗原 再次进入机体的细胞中时，致敏T细胞（效应T细胞）对抗原的直接杀伤作用及致敏T细胞 所释放的细胞因子的协同杀伤作用，统称为细胞免疫,细胞免疫（cellular immunity,14,一）免疫应答的3个阶段,15,NK细胞效应过程,

6、ADCC,16,异常的免疫反应包括：免疫抑制和免疫增强。 免疫增强：是指机体过度的或不适当的免疫反应状态。 病理反应：超敏反应和自身免疫反应,二）免疫应答的病理反应,17,超敏反应,主要是指机体再次接触同一抗原时所发生的不同形式的免疫病理损害过程。 I型速发型；II型细胞毒型或细胞溶解型；III型免疫复合物型或血管炎型； IV型迟发型,18,19,自身免疫反应,是指机体免疫系统对自身抗原发生免疫应答，产生自身抗体和（或）自身致敏淋巴细胞，引起机体病理损害甚至导致疾病的过程。 自身免疫性疾病的临床表现很复杂，目前已知至少有20多种，可以分为器官特异性和器官非特异性。如胰岛素依赖型糖尿病(IDDM

7、)，系统性红斑狼疮(SLE,20,自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮(SLE,侵犯皮肤和多脏器的一种全身性自身免疫病。某些不明病因诱导机体产生多种自身抗体(如抗核抗体等)，导致： 自身抗体与相应自身抗原结合为循环免疫复合物，通过III型超敏反应而损伤自身组织和器官； 抗血细胞自身抗体与血细胞表面抗原结合，通过II型超敏反应而损伤血细胞。 临床表现：皮疹常见，约40%患者有面部典型红斑称为蝶形红斑。急性期有水肿、色鲜红，略有毛细血管扩张及磷片状脱屑，严重者出现水疱、溃疡、皮肤萎缩和色素沉着。手掌大小鱼际、指端及指（趾）甲周红斑，身体皮肤暴露部位有斑丘疹、紫斑等。出现各种皮肤损害者约占总患病数的80%

8、，毛发易断裂，可有斑秃。1520%患者有雷诺现象。口腔粘膜出现水泡、溃疡、约占12%。少数患者病程中发生带状疱疹,21,第一节 免疫毒理学概述,一）免疫毒理学的主要研究内容 1，免疫毒性及作用机制研究 2，免疫毒性评价的方法学研究 3，免疫毒性的危险度评价,22,第一节 免疫毒理学概述,二）外源化学物对免疫系统作用特点 1，反应的灵敏性 2，反应的选择性 3，剂量-反应关系复杂,23,怎样提高免疫力,12月5日是世界强化免疫日,24,第二节 免疫毒性作用及其机制（重点,免疫抑制免疫抑制是指由于各种因素影响，使得机体对抗原的应答能力低下甚至缺失的现象。造成免疫抑制的因素很多，包括疾病、应激、营养

9、等。由病原微生物感染而引起的免疫抑制尤为严重，人类的获得性免疫缺陷综合征（AIDS）就是由病毒引起免疫抑制的典型代表。 超敏反应超敏反应（hypersensitivity ），即异常的、过高的免疫应答。即机体与抗原性物质在一定条件下相互作用，产生致敏淋巴细胞或特异性抗体，如与再次进入的抗原结合，可导致机体生理功能紊乱和组织损害的免疫病理反应。又称变态反应。 自身免疫是指机体免疫系统对自身抗原发生免疫应答，产生自身抗体和（或）自身致敏淋巴细胞，引起机体病理损害甚至导致疾病的过程,25,具有免疫抑制作用的外源化学物种类： 药物：肿瘤细胞减灭剂（化疗药物）、麻醉药等 工业化学物：有机溶剂、多卤代芳烃

10、等 重金属及其化学物、空气污染物等。 嗜好品：乙醇、烟草等,一、免疫抑制,外源化学物引起免疫抑制的机制,直接作用,间接作用,免疫器官 免疫细胞 免疫分子,功能改变 结构改变 混合改变,神经系统 内分泌系统 继发于其它靶器官毒性,代谢活化 激素水平改变,27,28,外源化学物免疫抑制的机制,1，干扰免疫细胞在 胸腺和骨髓的发育 （1、2） 2，干扰抗原提呈机制 （3、4） 3，干扰T细胞功能 （5） 4，干扰B细胞功能 （6） 5，干扰细胞增殖（7,直接作用,29,外源化学物免疫抑制的机制,间接作用,影响神经内分泌系统的调节功能 继发于其它靶器官毒性,NF-B信号通路,31,二、超敏反应,常见的

11、引起超敏反应的主要外源化学物有： 药物：青霉素类、 磺胺类等； 食品：蓖麻子、 生咖啡豆等； 化学品：美容护肤品、 香水等； 工业化学品：乙二胺、邻苯二甲酸酐等； 植物：毒常青藤、 橡树等； 混合有机体：棉尘、木尘等,变态反应,32,1）外源化学物本身作为抗原或半抗原而引发超敏反应。直接 2）改变抗体免疫应答的敏感性或强度而导致超敏反应。直接或间接,引起超敏反应机制,Coombs 和 Gell 将超敏反应分为四型，代表组织损伤的四种不同机制,33,I型,34,I型超敏反应机制,致敏阶段,发敏阶段,35,II型,36,II型超敏反应机制,37,III型,38,III型超敏反应机制,只有沉积于局部

12、 才有致病作用,39,IV型,致敏,此时致敏 是产生 活化T细胞 和记忆T细胞， 而不是产生抗体,40,IV型超敏反应机制,41,三、自身免疫,42,1）引发机体针对自身抗原产生自身抗体进行免疫应答。 2）引发机体产生针对自身抗原的自身应答性T细胞进行免疫应答。 3）造成自身隐蔽抗原的暴露或释放、改变自身抗原或形成新的自身抗原，从而引起自身免疫。 4）改变血细胞或其他组织细胞的抗原性，这种改变了的抗原刺激机体产生自身抗体。 5）影响正常的免疫调节功能，如激活对自身抗原处于耐受态的T细胞，或通过抗原提呈细胞表面辅助刺激因子异常表达， 或引起Th1和Th2功能失衡，引起自身免疫,外源化学物引起自身

13、免疫的机制,43,因先天性或继发性免疫系统功能不全的疾病。 发生免疫缺陷的原因：先天性免疫系统遗传因素异常、感染、药物作用、外源化学毒物接触、罹患疾病、营养不良等。 免疫缺陷的主要临床症状： 1）高度可疑：反复感染、慢性感染、偶见的传染因子、感染与治疗效果间的关系不甚明确。 2）中度可疑：皮疹、慢性腹泻、严重发育不良、 反复 性脓肿、反复性骨髓炎、 肝脾大。 3）特殊的免疫缺陷症状：共济失调、毛细血管扩张等,免疫缺陷(immunodeficiency,ID,常见的具有免疫毒性作用的物质,有机物,无机物,46,二恶英的免疫毒性,靶器官：免疫系统 （胸腺） 低剂量二恶英即可攻击免疫系统。猴子暴露二

14、恶英的浓度仅为10ng/Kg时，白细胞数量就会降低； 啮齿类动物，围产期暴露于TCDD会影响胸腺的发育，导致细胞免疫的持续性抑制。而且在围产期暴露比成人暴露引起的T细胞功能减弱更大、更持久,47,直接作用：对体液免疫和细胞免疫均有抑制作用，能减少B细胞的数量； 间接作用：通过影响内分泌系统发挥作用 （ TCDD和相关化合物能干扰内分泌系统，改变糖皮质激素、性类固醇激素、甲状腺激素、生长激素等的活性,二恶英的作用机制,48,金属的免疫抑制作用,铅、汞、镍和镉等金属与CD4+细胞的激活或引起抗体反应和细胞免疫抑制有关； 铅：降低对感染性疾病的抵抗力 砷化物：患病毒性带状疱疹的发病率较高,49,缺锌

15、影响机体免疫功能,影响淋巴细胞增殖分化 影响免疫记忆 影响免疫细胞分泌细胞因子 影响吞噬细胞和NK活性,50,铅对免疫功能的影响,铅具有免疫毒性，在较低剂量可引起免疫功能改变，增加机体对内毒素和病原体的易感性 体液免疫：抗体减少、B细胞表面受体减少、免疫记忆丧失 细胞免疫：增殖分化障碍 非特异性免疫：巨噬细胞数量减少，功能降低,汞对免疫功能的影响,中枢神经系统的不可逆损伤 大剂量导致免疫功能下降和免疫抑制 小剂量引起自身免疫性疾病 与遗传因素和个体敏感性关系密切 与TH1/TH2失衡有关 以肾炎为主 抑制巨噬细胞分泌TNF 、NO 引起细胞凋亡,52,第三节 免疫毒性作用的试验方法与评价,53

16、,一、检测方法,一）免疫病理学检查 （二）免疫功能检测 （三）超敏反应和自身免疫反应 （四）免疫细胞因子的检测,54,一） 免疫病理学检查,观察免疫器官大小、重量和大体形态； 观察胸腺、脾脏、淋巴结和骨髓的组织结构和细胞类型； 检查局部黏膜相关淋巴组织（包括肠、皮肤、鼻、支气管等黏膜相关淋巴组织） 利用荧光标记单克隆抗体和流式细胞仪观察淋巴细胞表面标记检查淋巴细胞表型 用常规染色和免疫组化观察组织结构,55,FIG. 2. (A) Low magnification of a normal thymus from a control rat exhibiting a cortex: medul

17、la ratio of approximately 2:1 (40). (B) High magnification of a normal thymus cortex from the same rat in (A) (400). The arrow indicates an apoptotic body. (C and D) Thymus from a rat treated with 5 mg PFNA/kg/day (C) The thymus shows a cortex: medulla ratio of approximately 1:1 (40). (D) Increased

18、numbers of apoptotic lymphocytes and tingible body macrophages with intra cytoplasmic apoptotic bodies (arrows) are evident in this thymus (100,二）免疫功能的测定,免疫功能检测,获得性免疫应答,固有性免疫应答,细胞免疫功能检测,体液免疫功能检测,巨噬细胞功能检测,NK细胞活性测定,宿主抵抗力试验,ELISA 免疫电泳法 血凝法 空斑形成细胞,细胞毒性T细胞杀伤试验 T淋巴细胞增值试验 迟发型超敏反应,NK细胞对敏感肿瘤细胞的溶解作用,放射性核素铬标记的

19、鸡红细胞吞噬法,宿主抵抗力试验模型,57,NK细胞活性测定,主要观察NK细胞对敏感的肿瘤细胞的溶解作用。将接触和未接触外源化学物的动物脾淋巴结与同位素 （51Cr） 标记的靶细胞共同孵育，NK细胞溶解肿瘤靶细胞，将同位素释放至培养液。培养结束后离心分离上清液，用计数仪测定同位素强度，51Cr的放射性脉冲与NK细胞活性成正比可反应NK细胞活性,NK cell,target cell,51Cr,自然杀伤组,自然释放组,最大释放组,NK活性（自然杀伤率%） （试验组cpm-自然释放组cpm）/（最大释放组cpm-自然释放组cpm）100,58,巨噬细胞功能检测 放射性核素铬标记的鸡红细胞吞噬法。从小

20、鼠腹腔收集巨噬细胞，在24孔板贴壁生长，加51Cr-cRBCs孵育后，弃去上清中的51Cr-cRBCs，再氯化铵短暂培养，去除与巨噬细胞结合但未被吞噬的51Cr-cRBCs。最后用NaOH溶解巨噬细胞，测定溶解液中的放射 强度,59,体液免疫功能检测 一般用特意性抗原免疫动物，刺激脾B细胞 活化并分泌抗体，然后观察抗体生成量或抗 体形成细胞数。前者用ELISA 、免疫电泳法、 血凝法等直接测定血清抗体浓度，后者常用 空斑形成细胞试验,60,细胞免疫功能检测 最常用的方法是细胞毒性T细胞杀伤试验（CTL）、T淋巴细胞增殖试验和迟发型超敏反应。 CTL试验评价脾T-淋巴细胞识别和溶解经抗原处理靶细

21、胞的能力。 淋巴细胞增殖功能一般选用不同有丝分裂原刺激体外培养的淋巴细胞，然后观察淋巴细胞增殖情况。 DHT试验先用某种抗原致敏，再用相同抗原作皮肤试验，观察局部以出现红肿为特征的迟发型超敏反应,61,一般用被动皮肤过敏试验（PCA）、主动皮肤过敏试验（ACA）、全身主动皮肤过敏试验（ASA）检测型超敏反应，多用于检测蛋白或多肽的致敏性。抗体滴度检测。 目前没有预测药物II型和III型超敏反应的标准实验方法。 检测型超敏反应最常用的是局部封闭涂皮试验（uecher test, BA)、豚鼠最大值试验（GPMT)和豚鼠迟发性皮肤超敏反应（DHR）。 目前还没有检测药物自身免疫反应的标准方法。鼠局

22、部淋巴结试验（LLNA）可以用于自身免疫反应。 免疫原性比较困难。人与动物区别；药物的生物学特征很容易改变。 假过敏或者类过敏反应。 不良免疫刺激，与假过敏之间有交叉,三）超敏反应和自身免疫反应,62,四）免疫细胞因子的检测 检测方法主要有：生物学测定、免疫学测定、分子 生物学测定和流式细胞仪测定等。 生物学测定（生物活性测定），主要是根据各种细 胞因子的不同生物活性检测。 免疫学测定，主要利用细胞因子蛋白或多肽的抗原 性，获得特意抗血清或单克隆抗体，利用抗原抗体特异性反应的特性，用免疫学技术定量检测细胞因子。常用有酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫试验（RIA）和免疫印记（immun blot）等,63,64,分子生物学技术的应用 免疫沉淀法、Western-Blot 分析技术检测、 PCR技术、原位杂交技术、orthern 印记 和斑点杂交技术等。 分子生物学技术的应用主要包括： 早期细胞损害的生物损伤的诱导反应