发酵工艺重点

1、第一章 绪论发酵的定义：通过微生物的生长和代谢活动，产生和积累人们所需代谢产物的一切微生物培养过程。发酵工程：是指利用微生物的生长繁殖和代谢活动来大量生产人们所需产品过程的理论和工程技术体系。微生物发酵产品分为（按发酵类型）：微生物菌体细胞、酶制剂和酶调节剂、微生物代谢产物（包括初级代谢产物和次级代谢产物）以及微生物转化、工程菌发酵产物等。发酵培养方法：表面培养发酵法和深层培养发酵法。液体深层培养法的基本工艺过程：菌种选育、孢子制备、种子制备、发酵培养、发酵液预处理、提取精制、成品检验、成品包装。第二章 菌种选育工业发酵三个技术领域：菌种选育、发酵工艺（上游工程）和分离提取工艺（下游工程）。菌

2、种选育在发酵生产上的目的：提高发酵产量、改进菌种性能、产生新的发酵产物、去除多余的组分。微生物突变的修复：光修复、切补修复、重组修复、SOS修复系统、DNA聚合酶的校正作用。菌种选育的方法：自然选育、诱变育种、杂交育种、基因工程育种、原生质体育种。自然选育（natural screening）：是指利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持或高于原有生产菌株的过程，以达到稳定或提高生产的目的。菌种退化：菌种在长期的传代保存过程中，由于自发突变使菌种变得不纯，生产能力下降。原因有菌种遗传特性的改变、经诱变剂处理后的退化变异、菌种生理状况的改变（培养条件）

3、。自然选育的一般过程：单孢子悬浮液的制备、分离出单菌落、单菌落传斜面、摇瓶初筛、菌种保藏、摇瓶复筛、放大试验。诱变育种（ mutation breeding ）是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群体，促进其突变率大幅提高，然后采用简便、高效的筛选方法，从中选出少数具有优良性状的突变菌株。主要包括出发菌株的选择、诱变处理和筛选突变株 三个部分。诱变育种的步骤：出发菌株的选择、悬浮液的制备、诱变处理、中间培养、突变株的分离和筛选。自发突变：微生物未经人为诱变剂处理或杂交等生物技术手段而自然发生的突变。诱发突变：人为用化学、物理诱变剂处理微生物而引起的突变。表型延迟：微生物表型的改变总是

4、落后于基因型改变的现象。理性化筛选（定向筛选）：运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。初级代谢产物高产菌株的筛选： 筛选细胞膜透性改变的突变株、筛选营养缺陷型突变株、筛选结构类似物抗性突变株。次级代谢产物（主要是抗生素）高产菌株的筛选：筛选营养缺陷型突变株、筛选负变株或零变株的回复突变株、筛选去磷酸盐调节突变株、筛选去碳源分解代谢调节突变株、筛选氨基酸结构类似物抗性突变株、筛选二价金属离子抗性突变株、筛选前体或前体结构类似物抗性突变株、筛选自身所产的

5、抗生素抗性突变株。影响原生质体制备的因素：培养基组成、菌龄、酶浓度、酶解温度和PH、酶解时间、渗透压稳定剂。影响原生质体再生的因素：再生培养基组成、培养基中水分、菌体生理状态、稳定剂、酶作用浓度及时间。原生质体融合的一般过程：遗传标记的选择、再生亲本原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体的再生、融合子的选择。第三章 培养基培养基：人工配制的、供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物的多种营养物质的混合物。培养基成分包括：碳源（能源）、氮源 、磷源、硫源、 无机盐、水、生长因子 、前提、促进剂、抑制剂速效碳源、氮源和迟效碳源、氮源生理酸性（碱性）物质：经过微生物代谢作用后，形成酸性（碱性）物质的

6、营养成分。前体：微生物代谢产物的合成过程中，能直接被微生物利用构成产物分子结构的一部分，而化合物本身的 结构没有大变化的物质。诱导物：一般指一些特殊的小分子物质，在微生物发酵过程中添加这些小分子物质后，能够诱导代谢产物 的生物合成，提高发酵产量。促进剂：是指那些细胞生长非必需的，但加入后却能显着提高发酵产量的一些物质，常以添加剂的形式加 入发酵培养基中。抑制剂：发酵过程中加入某些化学物质会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而获 得所需代谢产物，或使正常代谢产物的中间产物积累的物质。发酵生产培养基：抱子培养基 /斜面培养基，种子培养基，发酵培养基和补料培养基。影响培养基质量的因

7、素：原材料质量、水质、灭菌、培养基粘度。 培养基的筛选方法：单因子试验法、正交试验、均匀设计。第四章灭菌与除菌染菌的危害：消耗基质或产物，造成生产能力的下降；反应异常（pH值），提取更加困难；生产菌细胞将被裂解，使生产失败。湿热灭菌法：利用饱和蒸汽灭菌，使微生物体内的蛋白质发生凝固作用而致死。特点是蒸汽有很强的穿 透力，冷凝时放岀大量的潜热，来源方便，价格低廉，灭菌效果好，是目前最基本的适合培养基和设备的灭菌 方法。一般条件为： 121C, 30 min。热阻：微生物在某一特定条件（主要指温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻：某种微生物在某一条件下的致死时间与另一种微生物在相同条件下的比值。

8、对数残留定律和对数穿透定律，t=2.303/k * lg（N 0/Nt）和L=1/K * ln（N 0/Nl）分批灭菌：将配制好的培养基输入发酵罐内，用直接蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一定 时间，再冷却至发酵要求的温度，这一工艺过程称分批灭菌（实罐灭菌）。优点：设备要求低，操作简便。缺 点：营养成份有损失；罐利用率低；不能采用高温快速灭菌工艺连续灭菌：将配置好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温、和冷却而进行灭菌。优点：可采用高温短时灭菌，培养基受热时间短，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；发酵罐利用率高；可采用高温短时灭菌。缺点：不适合容积小的发酵罐。空气除菌的

9、方法：辐射杀菌、热杀菌？、静电除菌、过滤除菌。深层过滤原理：微粒气流运动方向改变引起微粒对滤层纤维产生惯性冲击滞留、阻截滞留、重力沉降、 布朗扩散、静电吸附等作用而把微粒滞留在纤维表面上空气过滤除菌设备：前过滤器、空气压缩机、冷却器、分水器、储气罐、加热器、总过滤器等。无菌检查的方法：肉汤培养法、显微镜检查法（镜检法）、平板划线培养或斜面培养检查法染菌来源：空气系统、设备、培养基、种子、工艺操作等第五章菌种制备与保藏发酵生产中种子必须满足的条件：生长活力强、生理形状稳定、菌体数量足够、无杂菌污染、生产力稳定。生产菌种的制备一般包括两个过程：抱子制备和种子制备。菌种进入种子罐的两种方法：抱子进罐

10、法（生长快）和摇瓶菌丝进罐法（生长慢）。种子制备：将固体培养基上培养出的抱子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的 过程。n级种子一一n+1级发酵种子罐的级数取决于：菌种性质；菌体生长速度；发酵设备的合理利用。影响抱子质量的因素：培养基、培养温度和湿度、培养时间和接种量。影响种子质量的因素：培养基、培养条件、种龄和接种量。菌种保藏目的：保持优良菌种生产性能的稳定、不污染杂菌、不死亡。原理：根据菌种的生理生化特 性，人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态菌种保藏方法：斜面低温保藏法、液体石蜡封存保藏法、固体曲保藏法、沙土管保藏法、冷冻干燥法、 液氮超低温保藏法。引起菌种退化的

11、原因主要有：基因突变、变异菌株性状分离、连续传代；其它因素：温度、湿度、培养 基、培养条件第六章 发酵过程中的供养摄氧率丫（OUR, Oxygen Uptake Rate ）:单位体积培养液每小时消耗氧的量。呼吸强度QO2:单位重量干菌体在单位时间内所吸取的氧量。呼吸临界氧浓度 :在溶氧浓度低时,呼吸强度随溶解氧浓度的增加而增加,当溶氧浓度达某一值后,呼 吸强度不再随溶氧浓度的变化而变化,此时的溶氧浓度称为临界氧浓度。影响微生物需氧量的因素:微生物种类和生长阶段、培养基的组成、培养液中溶解氧浓度、培养条件、CO2 的影响。氧传递的阻力:供养阻力和需氧阻力。氧的传递速率 N = K La（C*-

12、C L），影响供氧的主要因素有KLa和氧传递推动力 C*-C L气泛点 :在特定条件下,通入发酵罐内的空气流速达某一值时,使搅拌功率下降,当空气流速再增加时, 搅拌功率不再下降，此时的空气流速称为 “气泛点 ”（ Flooding point ）。发酵液中溶解氧浓度的测定:亚硫酸钠测定法、（普遍采用）复膜氧电极测定法第七章 发酵过程的控制 发酵类型（按操作方式）:分批发酵、补料分批发酵和连续发酵。按与氧关系:需氧发酵和厌氧发酵。按发酵动力学参数的关系:生长偶联型、部分生长偶联型和非生长偶联型。初级代谢:细胞在生命活动过程中进行的与菌体生长、繁殖相关的一类代谢活动，其产物即为初级代谢产 物。特点

13、:生长分为几个阶段（延迟期、对数期、稳定期、死亡期）；营养物质的消耗与菌体生长密切相关； 代谢产物的合成与菌体生长紧密相关。次级代谢:菌体生长阶段、产物合成阶段、菌体自溶阶段3 个阶段。菌体浓度 （cell concentration）: 单位体积培养液中菌体的含量。影响因素:微生物种类和遗传特性、营养物质 的种类与浓度、菌体生长环境条件。临界菌体浓度：为获得最高生产率，需采用摄氧速率与传氧速率相平衡时的菌体浓度，称，是菌体的遗传特性和发酵罐的传氧特性共同影响的结果。最适菌体浓度:在一定发酵条件下，使微生物的呼吸不受抑制时的最大菌体浓度。 碳源的浓度控制方法:经验方法（中间补料）、动力学方法（

14、根据菌体比生长速率、产物比合成速率、糖 比消耗速率来控制）。发酵培养基一般选用快速利用和缓慢利用的氮源组成的混合氮源。抗生素发酵，通常采用 生长亚适量 的磷酸盐浓度。温度对发酵的影响:影响酶的活性、影响发酵液的物理性质、影响代谢产物的合成方向。 发酵热:就是发酵过程中释放出来的净热量，是各种产生的热量减去各种散失的热量所得的净热量。 生物热:微生物在生长繁殖过程中产生的热量；影响因素有菌种、培养基、培养时间和菌体呼吸强度。 最适发酵温度的选择:根据 不同发酵阶 段和 发酵条件 ，选择最适温度。pH 对发酵的影响 : 影响酶活、影响基质或中间产物的接力状态、影响发酵产物的稳定性。影响发酵 pH

15、变化的因素:菌种遗传特异性、培养及成分、发酵工艺条件。发酵过程 pH 的确定:根据发酵阶段控制（一般5-8）和发酵实验结果。控制 pH 的方法:调节培养基的组成、补料、加入缓冲剂、加入酸或碱、改变发酵条件。 引起溶氧异常下降的原因:1）污染好气性杂菌；2）菌体代谢发生异常现象，需氧要求增加；3）设备或工艺控制发生故障或变化 引起溶氧异常升高的原因:1）菌体代谢出现异常，耗氧能力下降；2）污染烈性噬菌体（影响最为明显），产生菌未裂解前呼吸已受抑制，直到菌体破裂完全失去呼吸能力， 溶氧直线上升溶氧控制的一般策略：前期大于临界溶氧浓度，中后期满足产物的形成。 发酵初期采用小通风，停搅拌CO2 影响：

16、对微生物生长和发酵具有刺激或抑制作用；通气搅拌是控制 CO2 浓度的一种方法。 补料分批培养（ FBC ）：又称半连续培养或半连续发酵，指在分批培养过程中，间歇或连续地补加一种或 多种成分的新鲜培养基的培养方法，是分批培养和连续培养之间的一种过渡培养方式。补料分批培养的优点（与分批培养比）：可以解除培养过程中的底物抑制、产物反馈抑制、葡萄糖分解阻 遏效应；可以避免在分批培养过程中因一次性投糖过多造成的细胞大量生长、耗氧过多以致通风搅拌设备不能 匹配的状况；可为发酵过程的自动控制和最优化控制提供必需的方法。FBC 的作用：控制抑制性底物浓度、解除或减弱分解产物阻遏、使发酵过程最佳化。FBC 补料

17、原则：控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。 泡沫形成的原因：通气搅拌的强烈程度、培养基原料组成、菌种、灭菌质量、发酵液物理性质。 泡沫的不利影响：装料系数减少、氧传递系数减少、染菌几率增加、菌体呼吸受阻。 泡沫的控制：调整培养基中的成分及改变发酵工艺、消除泡沫（机械消沫和消沫剂消沫）。第八章 次级代谢产物的合成 初级代谢产物：与微生物的生长密切相关的代谢产物，包括氨基酸、蛋白质、核酸、维生素等。主要特点 有微生物生长所必需、各种微生物所共有。次级代谢产物：与微生物生长繁殖无关的代谢产物，包括色素、抗生素、生物碱、毒素等。主要特点：菌 属特异性、特定生长阶段产物及多组分混合物

18、。分叉中间体：微生物代谢过程中，既可以被微生物用于合成初级代谢产物，又可以用于合成次级代谢产物 的中间代谢物，如 a -氨基己二酸。初级代谢产物与次级代谢产物关系：初级代谢产物是次级代谢产物的前体，并影响次级代谢产物的合成。 合成次级代谢产物的构建单位：氨基酸及其衍生物、糖及氨基糖、聚酮体及其衍生物 、核苷酸衍生物等。次级代谢产物的合成过程：构建单位的合成、构建单位的连接、产物合成后的修饰。第九章 次级代谢产物合成的调控在发酵工业中，调节微生物生命活动的方法很多，包括生理水平、代谢途径水平和基因调控 水平上的各种调节。次级代谢产物生物合成的主要调控机制有：诱导调节、反馈调节、碳分解产物调节、氮

19、分解产物调节、磷 酸盐调节、生长速率调节及化学调节因子调节。微生物的代谢调节：酶代谢调节 酶活性的调节 、基因调节 酶合成的调节 （反馈调节）反馈阻遏与反馈抑制：调控水平分别是 DNA 水平（表达阻遏蛋白，产生效应慢）和酶分子变 构（变构效应，产生效应快）。酶活力调节：是指一定数量的酶通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率，一般是通过 激活或抑制已有酶的活力来实现，其特点是反应快速。酶的激活剂主要是金属离子代谢激活作用 ：前体激活、代谢中间产物激活酶活性的抑制主要是 反馈抑制酶合成调节 是通过酶量的变化来控制代谢速率水平上起作用，包括合成诱导（乳糖操纵子）和合成阻遏（色 氨酸操作子）。酶合成的诱导作用可表现出协同诱导和顺序诱导两种情况。 对诱导调节控制的常用手段有：添加诱导物类似物、添加辅酶或辅助因子、利用组成型突变株 克服反馈调节，可从以下两方面着手：降低末端产物浓度、应用抗反馈突变株营养缺陷型：是指原菌