凝胶过滤及离子交换层析介质

1、第九章 凝胶过滤及离子交换层析介质,一.凝胶过滤介质,凝胶过滤:利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离的一种方法. 其基本原理是含有尺寸大小不同分子的样品进入层析柱后,较大的分子不能通过孔道扩散进入凝胶珠体内部.较小的分子可以通过部分孔道,更小的分子可通过任意孔道扩散进入珠体内部.从而使得小分子移动最慢,中等分子次之,不同分子尺寸的分子先后顺序不同流出层析柱,达到分离的目的,凝胶过滤示意图,凝胶装置图,色谱峰和分离结果,凝胶过滤的优点,分离条件温和,蛋白质不易变性,收率高,重现性好. 工作范围广,分离分子量的覆盖面大; 设备简单,易于操作,周期短,可连续使用多次,色谱柱的重要参数,1) 柱体积

2、：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因此柱体积又称“床”体积，常用Vt 表示。 外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用Vo表示。 内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，常用Vi表示。 不包括固体支持物的体积（Vg）。 支持物的体积（Vg） (2) 峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积，常用Ve 表示。当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。 当样品体积与洗脱体积比

3、较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处,凝胶过滤的用途,脱盐:用于无机盐和生物大分子的分离.上样量大,为凝胶体积的1/41/5,流速大于200cm/h 分级分离:用于分离分子大小相近的物质通常为大分子物质的分离,必须采用孔径适当、分离范围与分子大小相适应的凝胶，上样量小，仅为床体积的5%10%。 分子量测定 理论上柱长加长 有利于分离效果的提高，但实际上却对操作不利,体积排阻色谱法的特点,标准蛋白相对分子量曲线的制备： 选用四种蛋白：醛缩酶、血清白蛋白、碳酸酐 酶及抑蛋白酶肽制成的混合标样。考虑流速等

4、 因素对保留时间T的影响而选用了内标法、既 在混合标样中加入右旋糖酐蓝和酪氨酸作为内 标，进样后可同时测的完全排阻和完全进入填 料孔的两种内标的保留时间T0和Tt，用分配系 数Kd对相对分子量对数作图，从而保证结果有 良好的重现性,样品测定: 根据样品的保留时间T求出其分配系数Kd，由Kd 从标准蛋白相对分子质量曲线上查出相应的lgMr， 计算相对分子质量,流动相,用作流动相的溶剂必须能溶解试样; 与固定相凝胶性质相似，能浸润凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂应能使凝胶溶胀。 溶剂的粘度要低，高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果，尤其是具有低扩散系数的高分子量试样。 一定的离子强度,1) 常

5、用磷酸盐和硫酸盐进行离子强度的调节,2) 用氯化钠作离子剂，疏水作用最小,3) pH值不能太低，因为H+会腐蚀不锈钢柱,常用的有四氢呋喃、甲苯、邻二氯苯、二氯乙烷、氯仿、苯、二甲基甲酰胺和水等,一般来说，生物化学领域常采用水溶性溶剂，称为凝胶过滤色谱； 在合成高分子化学领域，常采用有机溶剂，称为凝胶渗透色谱。 四氢呋喃是最常用的流动相，它对样品有良好的溶解性能和低的黏度，并可使小孔径聚苯乙烯凝胶溶胀，因此被优先推荐使用,凝胶渗透色谱示差折光检测器 流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率有较大的差别。 凝胶过滤色谱紫外吸收检测器 使用在检测波长无紫外吸收的溶剂作流动相,流速,蛋白质分离时，流速对

6、分离度的影响是一个很 重要的因素，一般在低流速下蛋白质分离是比 较理想,样品容量,进样体积和样品的浓度将明显地影响蛋白质的 分离度,样品的浓度范围一般在0.01%-0.5,最好是高浓度、小体积、在一般范围内可以得 到好的分离效果。蛋白质的样品体积为柱体积 的1%-3%比较合适,蛋白质在变性条件下的分离,变性溶剂如6mol/L盐酸胍、8mol/L脲、0.1% 十二烷基硫酸钠(SDS)等有助于精确地确定蛋白 质的分子量,在变性溶剂中，柱的分离范围因此而移到 低分子量范围内,凝胶介质应具备的条件,介质本身为惰性物质，不与溶质、溶剂分子发生任何作用； 应尽量减少介质内含的带电离子基团，以减少特异性吸附

7、，提高蛋白质的收率； 介质内孔径大小要分布均匀，即孔径分布较窄。 凝胶珠粒大小均匀；均一系数?颗粒粗细? 介质要有良好的物理化学稳定性及较高的机械强度，易于消毒,凝胶过滤介质的种类,多糖类骨架的介质： 纤维素、葡聚糖及琼脂糖等。是目前生化分离中应用最广、数量最多的凝胶过滤介质。 特点：亲水性及生物分子相容性 缺点：压力降大，不易操作,凝胶过滤介质的种类,合成大分子骨架的介质： 高亲水性，经过共聚反应控制孔径的大小的一类合成骨架。包括聚丙烯酰胺类(Fupergit C,德国)，聚乙烯醇类(Toyppearl,日本)及羟甲基酰胺类等。 天然大分子与合成高聚物构成的混合骨架,主要的凝胶过滤品种-交联

8、葡聚糖,一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）交联葡聚糖是以环氧丙烷进行交联的葡聚糖珠状凝胶，其商品名为Sephadex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克干胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。Sephadex LH-20，是Sephadex G-25的羟丙基衍生物， 能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质,主要的凝胶过滤品种-交联葡聚糖,交联葡

9、聚糖凝胶（Sephadex）的性能： 溶胀性：选用前必须在过量的溶剂中充分溶胀，沸水浴可加速溶胀，但要避免剧烈搅拌； 化学稳定性：不溶于一切溶剂，在水、盐溶液、有机溶剂、碱及弱酸中性质稳定。 物理稳定性：pH中性湿态珠体可经受120C，30min高压灭菌； 机械强度：取决于交联度，高交联度的凝胶为刚性,主要的凝胶过滤品种-交联葡聚糖,交联葡聚糖凝胶衍生系 Sephadex LH系的用途： 用于有机溶剂的凝胶过滤，尤其适用于嗜脂性分子及制备各种天然产物； 结合凝胶过滤、分配色谱及吸附层析的特点，能分离结构非常相近的分子； 排阻极性与原母体凝胶相同， 分离效果优良，负载量可高达200mg标准样品/

10、ml凝胶,主要的凝胶过滤品种-琼脂糖系,二）琼脂糖凝胶： 商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，Pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。 Sepharose琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌法处理,主要的凝胶过滤品种-琼脂糖系,二）琼脂糖凝胶： Sepharose CL是琼脂糖珠体与2，3-二溴丙醇反应后具有共价交联键的产物。大大提高了珠体的热稳定性，非特异性吸收

11、少，可经受120C消毒。有CL-2B，CL-4B及CL-6B等型号,主要的凝胶过滤品种-琼脂糖系,二）琼脂糖凝胶： Superose是珠状琼脂糖经过二次交联而制备的新型凝胶。大大提高了刚性，进一步增强了化学稳定性,主要的凝胶过滤品种-琼脂糖系,二）琼脂糖凝胶： Sepharose Fast Flow 是经过高度交联的琼脂糖珠体，机械强度大大加强，流速快,主要的凝胶过滤品种-聚丙烯酰胺系,三）聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶P

12、（Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度,主要的凝胶过滤品种-Superdex,四）Superdex系列产品： 是葡聚糖以共价键方式结合到高交联的多孔琼脂糖珠体上形成的复合凝胶。将交联葡聚糖的优良过滤选择性及交联琼脂糖的物理化学稳定性集于一身，成为具有优良选择性及高分辨率的产品,凝胶过滤基础,凝胶使用前要首先要进行处理。 1）估计用量 选择好凝胶的类型后，首先要根据选择的层析柱估算出凝胶的用量。由于市售的葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶通常是无水的干胶，所以要计算干胶用量： 干胶用量(g)柱床体积(m

13、l)/凝胶的床体积(ml/g) 由于凝胶处理过程以及实验过程可能有一定损失，所以一般凝胶用量在计算的基础上再增加1020(质量分数,2)水中膨化 不同类型的凝胶所需的膨化时间不同。一般吸水率较小的凝胶(即型号较小、排阻极限较小的凝胶)膨化时间较短，在20条件下需24 h；但吸水率较大的凝胶(即型号较大、排阻极限较大的凝胶)膨化时间则较长。如果加热煮沸，则膨化时间会大大缩短，一般在15 h即可完成，而且煮沸也可以去除凝胶颗粒中的气泡。但应注意尽量避免在酸或碱中加热，以免凝胶被破坏。 琼脂糖凝胶和有些市售凝胶是水悬浮的状态，所以不需膨化处理。另外多孔玻璃珠和多孔硅胶也不需膨化处理,3）排除凝胶中气

14、泡 膨化处理后，要对凝胶进行纯化和排除气泡。纯化可以反复漂洗，倾泻去除表面的杂质和不均一的细小凝胶颗粒。也可以一定的酸或碱浸泡一段时间，再用水洗至中性。排除凝胶中的气泡是很重要的，否则会影响分离效果，可以通过抽气或加热煮沸的方法排除气泡,4）凝胶的保存 凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然后加入适当的抗菌剂. 通常加入0.02(质量分数)的叠氮化钠，4下保存。如果要较长时间的保存，则要将凝胶洗涤后脱水、干燥，可以将凝胶过滤抽干后浸泡在50(体积分数)的乙醇中脱水，抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱水，至95(体积分数)乙醇脱水后将凝胶抽干。置于60烘箱中烘干，即可装瓶保存。注意膨化的凝胶

15、不能直接高温烘干，否则可能会破坏凝胶的结构,凝胶层析的基本操作,1层析柱的选择 层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过100 cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1：251：100之间。用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比较短,2.装柱（凝胶层析柱,1）除去气泡的溶胀凝胶应与层析柱操作温度一致，装柱过程中温度也要恒定。 2）应调节有利于装柱的凝胶浆稀稠度

16、，适当稀释有利于装柱过程中气泡的排除。 3）将柱子固定在稳定的支架上，并保证其垂直。 4）先向柱内加满洗脱剂，检查是否漏水；再打开出液口，排出里面的气泡，特别是要排除床底支持物上的气泡。关闭出液口，使柱中洗脱剂的体积约占总柱体积的15,5）柱顼接上胶浆贮存器，将胶浆徐徐注人柱内。注意避免产生气泡。 6）柱装好后，停10min，然后打开出液口，排出过量洗脱剂。 7）柱内胶面上部保留23cm洗脱剂。再将恒压洗脱剂瓶与柱上端相连。流过至少2倍住体积的洗脱剂之后，流速开始稳定下来。 8）调节恒压洗脱剂瓶的高低位置，得到理想流速。检查流体静力压，不要超过规数值。如果使用蠕动泵，注意使流速不超过稳定后利用

17、重力调节所达到的流速，一般要低于后者10,9）检查柱装得是否均匀和V0的测定：用一个为该凝胶完全排阻的有色大分子物质作样品进行层析，则既检查了装柱质量也测定了V0。层析时，若有色区带移动不整齐，说明柱装得不好。此大分子的洗脱体积(Ve)就是该凝胶柱的空体积(V0)。蓝色葡聚糖(blue dextran)2000是平均分子质量为2106Da并与蓝色染料偶联的一种葡聚糖，通常用它来测 V0，对于葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和6 以上的琼脂糖凝胶均可用0.2 浓度的蓝色葡聚糖2000，它在265nm及630nm处都有吸收峰,3洗脱液的选择 由于凝胶层析的分离原理是分子筛作用，它不像其他层析分离方式主要

18、依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离，在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用，一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率，改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用，所以和其他层析方法相比，凝胶层析洗脱液的选择不那么严格,由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH值范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐,4.加样量 关于加样前面已经有所介绍，要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响

19、分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组分相对分子质量差异较大，加样量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的13(质量分数)左右,如果有条件可以首先以较小的加样量先进行一次分析，根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量。从洗脱峰上看，如果所要的各个组分的洗脱峰分得很开，为了提高效率，可以适当增加加样量；如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分开，则不能再加大加样量，甚至要减小加样量。另外加样前要注意，样品中的不溶物必须在上样前去掉，以免污染凝胶柱。样品的黏度不能过大，否则会影响分离

20、效果,5.洗脱速度 洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散,加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长；所以实验中应根据实际情况来选择合适的洗脱速度，可以通过进行预备实验来选择洗脱速度。一般凝胶的流速是210 mlh，市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考,总之，凝胶层析的各种条件，包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等

21、等，都要根据具体的实验要求来选择,二、离子交换法及离子交换剂,概念：通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法。主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离。 适应于蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物的分离纯化。生化分离中约75%的工艺采用离子交换法,一）原理,吸附:在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素OC6 H14N+H，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电

22、荷的蛋白质阴离子进行交换。当固定相结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy， CM）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素OCH2COO一），其反离子为阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换,一）原理,pH洗脱:溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多，依次为球蛋白

23、， 球蛋白和 球蛋白。 在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来,一）原理,交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当Cl一的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl一浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用两

24、种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值,常用离子交换剂的种类与特性,常用离子交换剂的种类与特性 通用型离子交换树脂功能基种类：适用于水处理，湿法冶金，化学合成及医药工业等用途广泛的离子交换树脂,常用离子交换剂的种类与特性,生化专用离子交换介质：主要用于生化领域，一般是凝胶过滤介质的衍生物，其骨架、粒径、排阻极限等与

25、母体相似。 纤维素类：具有松散亲水网络，大孔隙，表面积大等优点。 葡聚糖系：以Sephadex系的产品为主，在SephadexG25和G50两种凝胶介质上引入功能基后，产生的多离子交换介质,生化用离子交换剂的特点,1、亲水性及生物相容性：都具有亲水性，有很好的生物相容性。以天然大分子为主，依此特性选用含亲水基团的单体开发合成刚性或半刚性的离子交换剂,2、孔结构： 3、电荷密度：电荷密度要适当。 4、粒度：粒径小，分布均匀则分离效果好。 5、纯度：工业级，分析级，生物技术级，分子生物级,离子交换剂的处理、再生和转型,1)处理 取适量的固体离子交换剂先用水浸泡，待充分膨胀后即可进行处理。常规的处理

26、步骤是，加过量的水悬浮除去细颗粒，而后改用酸碱浸泡，以便除去杂质并使其带上需要的反离子。在每次用酸(或碱)处理后，均应先用水洗涤至近中性，再用碱(或酸)处理。末了用水洗涤至中性，经缓冲液平衡后即可使用或装柱,2）再生 使用过的离子交换剂，可采用一定的方法令其恢复原来的性状，这一过程叫再生。再生可以通过上述的酸、碱反复处理完成，但有时也可以借助转型处理完成。所谓转型是指离子交换剂由一种反离子转到另一种反离子的过程，转型后的离子交换剂会按使用要求带上一定种类的离子或基团。总之，对离子交换剂的处理、再生和转型的目的是一致的，即要求其带上使用时所期望的离子或基团,3）转型 长期使用的亲水性离子交换剂的

27、处理一般只用酸、碱浸泡即可。原则上讲，去除杂质的过程应在不破坏离子交换剂的结构和稳定性，不影响其原有交换容量的前提下进行。对于琼脂糖离子交换剂的处理是在使前仅用蒸馏水漂洗、缓冲液平衡后即可。其他亲水性离子交换剂的再生和转型操作和琼脂糖离子交换剂的一样,4.离子交换层析的基本操作 （1）层析柱 离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为1：101：50之间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡,2）装柱 先把柱内装满起始缓冲液，用玻璃棒挤压海绵，赶尽气泡并把柱子垂直固定；将交换剂用起始缓冲液调稀搅匀后加入，柱内的交换剂应非常均匀地分布，不应出现节面和气泡，不能干柱，床面要平整，床高距柱顶23cm为宜,3）平衡缓冲液 平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液