LZTFL1在胃癌等组织中的表达及其与不同黏附因子表达的医学相关性研究

1、LZTFL1在胃癌等组织中的表达及其与不同黏附因子表达的医学相关性研究第一部分 文献综述第一章 胃癌概述胃癌( Gastric Cancer)是我国现阶段最常见的消化道恶性肿瘤，存在早期诊断率较低，易发生局部和远处转移，患者生存期短、预后差及生存质量不佳等情况。2012 年中国肿瘤登记年报1显示其发病率仅次于肺癌，死亡率也占到了第三位，而在农村，胃癌的发病率更是高居榜首，甘肃仍是胃癌的高发区。胃癌的侵袭转移及术后复发是胃癌患者死亡的主要原因2,3。由于胃癌的形成和转移是一个极其复杂的过程，因此对于胃癌的研究从实验到临床的各个方面都有涉及。胃癌的形成和转移也是多因素参与的过程，与之相关的细胞粘附

2、、细胞信号传导、细胞代谢、细胞结构分子活性、酶调控活性、转录和翻译调控活性、转运调控活性及抗氧化活性等多类功能基因均参与胃癌的发生和转移4-6，目前国内外学者从胃癌病理和调控通路及影响胃癌形成的因素方面做了大量工作来对胃癌进行研究，但迄今为止，我们对于胃癌细胞侵袭转移过程中关键步骤涉及的确切分子机制仍不完全清楚。已有研究证实，多种信号通路的异常活化及相关基因的结构改变与表达异常均会导致胃癌的浸润转移。这些基因一部分起抑制肿瘤转移的作用；而另一部分则促进肿瘤的转移。转移抑制基因在体内直接抑制转移潜能，其失活甚至缺失会导致肿瘤的发生，目前胃癌中研究较多的肿瘤转移抑制基因有基质金属蛋白酶抑制因子 T

3、IMPs，nm23，Maspin、survivin、p53、PTEN 和 p16 等7-11。研究这些与肿瘤发生相关的关键基因的功能，对寻找抗肿瘤药物的作用位点和研究转移性胃癌靶向治疗的意义重大。而且，胃癌的浸润转移不仅与癌细胞自身基因结构改变与表达异常有关，还受到组织微环境的影响，涉及粘附、趋化等多种作用机制。下面仅就胃癌的上皮-间质转化及胃癌抑制基因有关进展作如下综述。.1.胃癌上皮-间质转化上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮细胞在特定的生理及病理状态下向间质样细胞转化的现象12。上皮细胞具有极性和紧密连接特性，在某些生理或病

4、理因素影响下失去原有极性和细胞形态，再经过细胞骨架重塑转变为具有移行能力、可侵入细胞外基质的间质细胞。这一概念最早见于发育生物学，主要参与胚胎发育、器官形成等生理过程13。随后的研究发现 EMT与多种慢性疾病组织纤维化的发病机制密切相关14，而近年来的研究发现，在胃癌15、肝癌16、肺癌17、乳腺癌18等多种肿瘤的侵袭和转移过程中均有 EMT的发生，EMT 在肿瘤细胞的生长、浸润及侵袭转移过程中发挥重要作用，已成为现在肿瘤研究的一个热点问题。研究胃癌侵袭和 EMT 的发生机制，有利于寻找治疗靶点，从而为胃癌的治疗提供一定的指导。EMT 过程伴随多种基因和表型的改变，涉及多个信号通路及相关基因，

5、其中细胞粘附分子的表达改变是一个很重要的方面。上皮-间质转化发生过程中上皮的极性丧失，而上皮细胞标记物 E-钙粘蛋白(E-cadherin, E-cad)、β-连环蛋白(β-cat) 等细胞黏附分子表达下调，细胞的骨架结构发生改变，而间叶表型标记物 N-钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白（vimentin）等表达上调19。下面就目前研究较多几种 EMT 相关蛋白做一简要介绍。钙粘蛋白是一类 Ca2+依赖性的糖蛋白分子，分布于上皮细胞中，主要参与并介导细胞与细胞间、细胞与基质之间的连接20。钙粘蛋白包括 E-钙粘蛋白(E-cadherin) 、 P- 钙粘蛋白 (P-

6、cadherin) 和 N- 钙粘蛋白 (N-cadherin) 等，其中E-cadherin 和 N-cadherin 是 EMT 的关键分子，其表达变化可以反映肿瘤侵袭转移的情况21。E-cad 编码基因定位于人类染色体16q22.1上，相对分子量120KDa。E-钙粘蛋白作为一种钙依赖性跨膜糖蛋白，多与细胞浆池中的α -连环蛋白、β-连环蛋白一起形成细胞粘附复合体（E-Cad-cat 复合体），作为上皮细胞间紧密连接的重要组分与肌动蛋白骨架结合，参与维护上皮细胞的正常结构和上皮极性，介导同质性细胞黏附，维持正常上皮细胞的生理功能。恶性肿瘤时往往出现E-cad 表达降

7、低、缺失或障碍，E-Cad-cat 复合体结构改变，导致细胞粘附能力下降，肿瘤细胞容易从原发部位脱落，经淋巴管血管运动迁移至靶器官继续生长，增加了肿瘤的侵袭力及转移风险，因而 E-钙粘蛋白的表达情况可以作为评价肿瘤 EMT 程度及恶性程度的参考指标22。N-钙粘蛋白(N-cadherin)也属于经典类钙粘蛋白，分子量 130KDa，编码基因定位于人类染色体 18q11.2 上。N-钙粘蛋白包括胞外段、跨膜段和胞内段三部分，其中胞内段部分可与 p120 连环素（p120ctn）、α-连环蛋白、β-连环蛋白连接形成复合体，用于调节细胞的粘附功能。在正常胚胎发育过程中 N-钙粘

8、蛋白参与心脏的发育，骨骼肌的分化，而在病理状态下，如上皮肿瘤中常能观察到 E-钙粘蛋白的缺失和 N-钙粘蛋白的重新表达。研究表明，肿瘤细胞中 N-钙粘蛋白的异常表达会增加细胞的活动性和侵袭性。.第二章 LZTFL1 的研究现状1.LZTFL1 的结构和生物学特性亮氨酸拉链转录因子样 1（Leucine Zipper Transcription Factor-like 1，LZTFL1）基因位于染色体 3p21.3 卢卡区 5Mb 处，是 Kiss 等人33在研究该区肿瘤抑制基因时首次发现并克隆的。Northernblot 分析表明 LZTFLl 的 mRNA 广泛存在于人类和小鼠组织中，其编码

9、含 299 个氨基酸残基的蛋白，分子量约为34.6KD。序列分析表明，LZTFLl 在人类与小鼠之间的序列同一性达到 90.6%34。多位学者的研究表明，3p21.3 区染色体的异常与人肾癌、肺癌、乳腺癌35以及头颈部、胃肠道和子宫等部位的肿瘤形成密切相关36-38，因此普遍认为该区存在多个与肿瘤发生密切相关的候选抑瘤基因，如 APRG1、ITGA9、 HYA22、VILL、RBM5、BLU 和 RASSF1A 等37-39。2011 年，Braga E 等人40还在 3p21.3上发现了新的抑癌基因集中区 MECA3，提示该区域存在多个肿瘤抑制基因及候选基因。LZTFL1 基因对应的 LZT

10、FL1 蛋白包含 299 个氨基酸，其结构包括一个基本结构域，一个螺旋-螺旋结构域和一个亮氨酸拉链结构域。亮氨酸拉链结构域的出现往往与癌基因的表达调控功能有关。这一结构特点和其所处的位置均提示LZTFL1 具有转录因子功能，生物信息学推测其可能能够抑制肿瘤33,41。LZTFL1 作为一种新发现的蛋白，目前国内外的研究还比较少。现有的研究一方面主要在 LZTFL1 与生长发育异常的关系研究，另一方面主要集中于LZTFL1 对癌症的抑制作用。.2. LZTFL1 与生长发育异常多位学者的研究发现 LZTFL1 的稳定表达对人体的发育影响很大，其表达降低或缺失会增加发育异常的风险，甚至引起一些遗传

11、性疾病的发生。SeongjinSeo 等研究发现，LZTFL1 是 Bardet-Biedl 综合征（BBS）初生纤毛运输和 Sonichedgehog 信号通路的重要调节基因42。Schaefer E 的研究则证实轴后多指趾畸形是LZTFL1(BBS17)突变的Bardet-Biedl综合症患者的主要特征43。Vincent Marion等人认为 LZTFL1 是一种新型的 BBS 基因(BBS17)44，他们通过对 Bardet-Biedl综合征患者的外显子组测序发现，患者 LZTFL1 纯合子 5bp 的缺失会引起 Sonichedgehog（Shh）信号通路的大范围异常激活。还有学者通

12、过对 LZTFL1 基因敲除小鼠模型与野生型老鼠的对比研究后认为 LZTFL1 是一种纤毛蛋白，其可能通过控制微管装配和纤毛的蛋白质转运来调节动物体重和光感受器连接纤毛的功能45。而另一些学者则认为 LZTFL1 是 ATRA-induced T 细胞反应的一个重要的调节剂，其研究数据显示 LZTFL1 可调节 T 细胞活化和 IL-5 水平46。在研究运动训练对认知障碍的作用时，有学者发现运动能诱导海马区 LZTFL1 的增加，而通过对 Neuro 2a 细胞中 LZTFL1 的过表达研究发现，LZTFL1 能够促进神经轴突的生长，对海马区认知障碍有预防作用47。.第三章 LZTFL1 及粘

13、附因子在人胃癌组织中表达的相关性分析.55前言.551.材料和方法.552.结果.563.讨论.60第四章 LZTFL1 及粘附因子在裸鼠胃癌高转移模型中的表达.62前言.621.材料和方法.622.结果.643.讨论.69第四章 LZTFL1 及粘附因子在裸鼠胃癌高转移模型中的表达前言对于胃癌病人，复发和转移是其死亡的主要原因，其中以淋巴结转移最为常见，有研究表明淋巴结转移是胃癌患者预后的独立危险因素，同时淋巴结转移灶可作为血行转移的桥头堡。转移性胃癌治疗研究焦点不仅在手术治疗，也包括结合化疗、放疗、靶向等的综合治疗。为了能够进一步研究胃癌转移机制、药物干预等抗转移治疗，需要一个适合的动物模

14、型。人胃癌转移裸鼠模型是研究胃癌转移机理的重要手段之一，借此可以在机体生理活动状态下研究与胃癌转移有关基因、分子活动以及各基因、分子之间的相互关系，进一步了解胃癌转移的分子机理。本项研究基于科室自行建立的裸鼠人胃癌高转移模型150 ，该模型是选择临床淋巴结转移率较高的低分化胃癌患者手术标本作为移植样本，通过裸鼠皮下移植，筛选出的一种可以通过皮下移植的高转移裸鼠模型，它最大限度的保留了原发肿瘤的特性，是一种适合研究胃癌转移机理的理想动物模型。本实验选取已建立的裸鼠人胃癌高转移模型的肿瘤组织样本和建模选取的临床胃癌患者组织标本，通过免疫组化和 RT-PCR 对高转移裸鼠模型和其对应接种临床胃癌患者

15、的LZTFL1、E-cadherin、β catenin、ICAM-1 和 VCAM-1 的表达进行检测，以发现相关基因在人体组织及裸鼠模型肿瘤中的表达情况及其对应关系。.结论本部分研究所选取的高转移裸鼠模型是自行研发的，该模型不仅可以稳定传代，保持原发瘤组织学特征，还具有 100%移植成瘤率和 94%的后腹膜转移及多器官微转移率，转移途径明确，模型胃癌细胞具有高转移特征。本研究模型选择的临床胃癌患者为低分化腺癌，癌组织浸润深达胃壁全层，间质伴多量炎细胞反应。镜下观察，癌组织已无明显胃腺管结构，癌细胞核大，呈巢状分布。免疫组化结果显示，LZTFL1 在癌区呈弥漫性浅着色，部分癌细胞深

16、染，染色定位于细胞浆。E-cadherin在癌区为阴性表达，几乎不着色，偶见癌细胞膜阳性/或浆阳性。β -catenin在癌区呈弥漫性浆着色。ICAM-1 在癌区为强阳性膜表达。VCAM-1 在癌区为强阳性膜表达，染色定位于癌区小血管内皮及部分癌细胞膜。LZTFL1、E-cadherin、β -catenin、ICAM-1 和 VCAM-1 的 mRNA均有不同程度表达，其中 ICAM-1、VCAM-1 和 β-cactenin 的 mRNA 表达量相对较高，而 LZTFL1 和 E-cadherin的 mRNA 表达量相对较低。而在传代接种至裸鼠后，其原位瘤仍为低分化腺癌。镜下观察，与原代胃癌患者胃癌组织相比，原位瘤中的癌细胞主要有两种形态，一种细胞核大，细胞成团生长，细胞间界限不明显。另一种细胞核较小，胞浆成分极少，细胞呈散在分布于整个瘤体组织。原位瘤