微生物检验技术基础知识课件

1、微生物检验技术,基础知识,目,录,一、微生物基本介绍,二、培养基,三、菌种,四、微生物限度检查法,一、微生物基本介绍,1,微生物的定义,微生物是一些形体微小，以单细胞或简单多细胞,甚至是没有细胞结构的形式存在的低等生物的统称,2,微生物的分类,微生物的主要分类单位：域、界、门、纲、目、科,属、种、变种、亚种（小种）、型、菌株（品系,种,是最本的分类单位，例：大肠埃希菌,一、微生物基本介绍,3,微生物的特点,体形微小,结构简单,生长繁殖快,种类繁多，分布广，适应性强,包括：细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、立克次氏体,支原体和病毒等,一、微生物基本介绍,4,微生物形态结构,4.1,细菌,4.2,真菌（

2、包括酵母菌和霉菌,一、微生物基本介绍,5,微生物与我们,每张人民币带细菌,900,万个,人体体表及体内存在大量的微生物,皮肤表面：平均,10,万个细菌,平方厘米,口腔“细菌种类超过,500,种,肠道：微生物总量达,100,万亿,二,培养基,配制时注意,不得使用结块或颜色发生改变的脱水培养基,常用的溶剂是纯化水、蒸馏水，避免使用自来水，因其中含,有氯等抗菌物质,脱水型培养基应完全溶解于水中，再分装灭菌,加热助溶，注意不要过度加热,如需要添加其它组分，加入后应充分混匀,配制用的容器最好用中性玻璃或聚乙烯容器,配制培养基一般要在,1,小时内完成，如果室温高，配制时间,过长，易使培养基受污染,二,培养

3、基,2,培养基的灭菌,已配制好的培养基最好尽快灭菌,一般培养基采用湿热灭菌，即高压蒸汽菌，通常是,121,15,分钟,湿热灭菌必须严格控制灭菌温度和时间，不可重复高温灭菌,高压蒸汽灭菌锅在使用时，内置物品不能太多，不要堆积形,成死角,要定期对压力表等进行检定，检定周期一般为半年,定期对灭菌效果进行检验，可采用生物指示菌法、化学变色,纸片（如湿热灭菌指示条）等进行验证,二,培养基,3,培养基的贮藏,贮藏注意,灭菌后的培养基应迅速取出，避免长时间保存在灭菌锅内,造成过度灭菌,培养基保存前应标上名称和制备日期（或到期日期,琼脂培养基不得在,0,或,0,以下存放,琼脂平板最好现配现用，如置冰箱保存，不

4、超过一周,二,培养基,4,培养的再融化方式,水浴加热,微波炉,注意,固体培养基灭菌后的再融化只允许一次,融化的培养基应置于,45,50,的水浴中，不得超过,8,小时,二,培养基,5,培养基的性能评估,所有购回的、配制好的培养基均应进行质量控制试验（培养,基适应性检查,理化指标,P55,微生物学指标,P55,三、菌种,1,分类（概念,标,准,菌,株,由国内或国际菌种保藏机构保藏的,标准储备菌株,由标准菌株经一次传代得到的培养物,商业派生菌株,由供应商提供的所有特性与标准菌株,等效的菌株,工,作,菌,株,由标准储备菌株以传代得到的培养物,三、菌种,注意,标准储备菌株、工作菌株都应进行纯度和特性确认

5、,工作菌株的传代次数不得超过,5,代（从菌种收藏机,构获得的标准菌株为第,0,代,1,代”是指将活的培养物接种到微生物生长的新,鲜培养基中培养,实验室必须建立和保存其所有菌种的进出、收集,贮藏、保存、确认试验及销毁的记录,三、菌种,标准菌株,冻干粉（图,P63,甘油冻存管（图,P64,三、菌种,菌种保藏机构,CMCC,中国医学微生物菌种保藏管理中心,GIMCC,广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心,ATCC,美国典型菌种保藏中心,例,CMCC,B,26003,菌种保藏机构,细菌,菌种编号（金黄葡萄球菌,三、菌种,2,菌种的鉴定,金黄色葡萄菌,CMCC (B) 26003,甘露醇平板上划线分纯，

6、典型菌落,为黄色圆形突起，表面湿润光滑,革兰氏染色：阳性，球菌,血浆凝固霉酶实验：阳性,三、菌种,铜绿假单胞菌,CMCC (B) 10104,溴化十六烷基三甲铵琼脂平板上划线分纯，典型菌,落呈扁平，无定形、周边扩散，表面湿,灰白色,周围有蓝绿色素扩散,氧化酶实验：阳性,绿脓菌素：阳性,革兰氏染色：阴性，杆菌,三、菌种,白色念珠菌,CMCC (B) 98001,沙氏葡萄糖琼脂平板上划线分纯，典型菌落乳白色,表面光滑有浓酵母气味,革兰氏染色：阳性，菌体大，球菌,芽管试验：阳性,三、菌种,3,菌种的保藏,A,甘油冷冻管保藏法,保藏温度,30,80,保藏菌种有效期,1,2,年,优点：保存期较长，反复传

7、代导致菌种变异的风险较小,缺点：操作相对复杂，成本较高,B,斜面低温保藏法,保藏温度,4,左右，保藏时间,1,3,个月，但铜绿假单胞菌不,宜用本法保存,优点：操作简便，成本低，比较容易掌握,缺点：保存期比较短，反复传代有引起变异的可能,保藏温度,保藏,有效期,优点,缺点,甘油冷冻管,保藏法,30,80,1,2,年,保存期较长,反复传代导致,菌种变异的风,险较小,操作相对复杂,成本较高,斜面低温,保藏法,4,左右,1,3,个月,操作简便,成本低,比较容易掌握,保存期比较短,反复传代有引,起变异的可能,铜绿假单胞菌,不宜用本法保,存,三、菌种,4,菌种的使用和销毁,过期菌种应及时销毁，销毁时应经,

8、121,30,分钟的,生物灭活处理,四、微生物限度检查法,1,定义,微生物限度检查法,系检查非规定灭菌制剂及其原,料、辅料受微生物污染程度的方法,2,检查项目,定量检查,细菌数、霉菌及酵母菌数,定性检查,控制菌（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞,菌、白色念球菌,检验环境：与无菌检查相同,四、微生物限度检查法,3,检验量,指一次检验用量,10g,或,10ml,膜剂为,100cm2,贵,重药品、微量包装药品的检验量可以酌减,4,供试液的制备,根据供试品的理化特性与生物特性，采取适宜的方,法制备供试液,供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不超,过,45,四、微生物限度检查法,制备原则,简便、快速,供试

9、液从制备至加入检验用培养基，不得超过,1,小,时,四、微生物限度检查法,供试品分类,液体供试品,固体、半固体或黏稠性供试品,需用特殊供试液制备方法的供试品,非水溶性供试品,膜剂供试品,肠溶及结肠制剂供试品,气雾剂、喷雾剂供试品,贴膏剂供试品,具抑菌活性的供试品,培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过,滤法、中和法,四、微生物限度检查法,5,方法验证,5.1,验证菌株,大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌,黑曲霉,5.2,计数方法的验证,当建立产品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵,母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的,细菌、霉菌及酵母菌数的测定,若产品的组分或

10、原检验条件发生改变可影响检验结果时，计,数方法应重新验证,四、微生物限度检查法,试验组,薄膜过滤法计数时：取规定量的供试液，过滤，冲洗，在最,后一次的冲洗液中加入,50,100cfu,试验菌，过滤，按薄膜过,滤法测定其菌数,菌液组,测定所加的试验菌数,50,100cfu,供试品对照组,取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数,稀释对照组,用相应的稀释液替代供试品，加入,50,100cfu,试验菌，按试,验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数,四、微生物限度检查法,验证方法,验证试验至少应进行,3,次独立的平行试验，并分别,计算试验菌每次试验的回收率不低于,70,若任一,次试验中试

11、验组的菌回收低于,70,应采取适宜的,方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行进行方法,验证,四、微生物限度检查法,5.3,控制菌检查法验证,当建立药品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法,的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查,采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌,10,100cfu,应加在最后一次冲洗液中，依法操作,若上述试验检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法,进行供试品的该控制菌检查,若试验组未检出试验菌，应采用相应方法消除供试品的抑菌,活性，并重新进行方法验证,四、微生物限度检查法,5.4,细菌、霉菌及酵母菌检查,检查方法,平皿法和薄膜过滤法,按已

12、验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数,检查,四、微生物限度检查法,菌落报告规则,细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于,300cfu,霉菌宜选取平均菌落小于,100cfu,的稀释级，作为菌数报告,即两位有效数字）的依据,如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有,菌落，但平均菌落数小于,1,时，以,1,乘以最低稀释倍数的值,报告菌数,四、微生物限度检查法,菌落报告,规则示例,各稀释级（供试液,1ml,皿）平均菌落计数,cfu,菌数报告数,cfu/ml.g,原液,1,10,1,1,10,2,2,1,10,3,3,1,64,8,2,640,2,420,64,8,6400,3,不可计

13、,420,64,64000,4,0,0.5,0,100,5,0,0,100,6,0,0,0,10,7,0,0,0,1,例：菌数报告规则表,1,四、微生物限度检查法,5.4.2,薄膜过滤法,滤膜孔径不大于,0.45,m,直径一般为,50mm,若需要用冲洗,液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量不超过,100ml,总冲洗量,不得超过,1000ml,贴膜,菌面朝上于相应的琼脂培养基平板上培养，每种培养,基至少制备一张滤膜,阴性对照试验,不得有菌生长,菌落报告规则,每张滤膜上的菌落数应不超过,100cfu,若滤,膜上无菌生长，以,1,乘以稀释倍数的值报告菌数,四、微生物限度检查法,5.5,控制菌检查,供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的,实际用量同控制菌检查方法的验证,阳性对照试验,加菌量为,10,100cfu,阳性对照试验应检,出相应的控制菌,阴性对照试验,取稀释液,10ml,代替供试液，阴性对照应无,菌生长,按照不同的给药途径，必检的控制菌不同,四、微生物限度检查法,不同给药途径制剂应检控制菌汇总,药品给药途径,应检控制菌,说明,局部给药制剂,金黄色葡萄球菌,所有制剂,铜绿假单胞菌,白色念珠菌,阴道给药,口服制剂,大肠埃希菌,所有品种,大肠菌群,含中药原药粉,沙门菌,含动物组织（提取物,给药,