4 高效液相色谱法

1、第四章,高效液相色谱法,High Performance Liquid Chromatography,本章要求,了解高效液相色谱法的优缺点,了解高效液相色谱仪的结构,掌握常用检测器的原理及应用范围,定义：以液体作为流动相的色谱法称为液相色谱法,高效液相色谱法,HPLC,20,世纪,60,年代末,70,年代,技术,高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器,特点：速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化,一,概述,4.1,高效液相色谱法简介,1,高效液相色谱法与经典液相色谱法比较,高速,HPLC,分离效率高，速度快，一次几分钟和几十分钟,就可完成。色谱柱的寿命长，可达两年以上,高效,HPLC,高压,26,M

2、Pa,下操作，填料颗粒小,250,m,规则均匀的固定相，传质阻力小，柱效高,N=400060000,块,m,分离效率高,高灵敏度,现代高效液相色谱仪普遍配有高灵敏度检测器,使分析灵敏度比经典色谱有大提高（紫外检测器最小检测,限可达,10,9,g,荧光检测器最小检测限可达,10,11,10,13,g,高自动化,HPLC,进样量小,XX0,L,带有自动进样装置,和工作站,2,高效液相色谱法与气相色谱法的比较,适用范围,GC,适用于沸点低、热稳定性好、中小分子量的化合物,HPLC,不受此种限制。气相色谱一般都在,较高温度,下进行,而高效液相色谱法则经常可在,室温条件,下工作,流动相,GC,流动相仅运

3、载样品，不起分离作用，但无毒，易于,处理。而,HPLC,流动相除了运载样品外，还有分离作用，可,改变流动相组成，进行有效的分离。但流动相一般有毒，费,用高,色谱柱,GC,柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效,很高,理论塔板数,N=10,4,10,6,HPLC,柱较短，一般为,1525,cm,柱效,理论塔板数,N=10,3,10,4,低于,GC,柱,检测器,与,GC,相比,HPLC,检测器种类较多,制备色谱,GC,难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏,HPLC,可进行制备，即制备色谱,一,高效液相色谱仪的结构,4.2,高效液相色谱仪,一般分为,4,个主要部分,高压输液系统、进

4、样系统、分,离系统和检测系统,此外还配有辅助装置：如梯度洗,脱、自动进样及数据处理等,工作过程如下,首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入,色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样,品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱,柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检,测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图,数据分析,系统,输液系统,进样系统,分离系统,检测系统,HPLC,的系统组成,数据处理系统,1,高压输液系统,一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组,成，其中高压输液泵是核心部件,高压泵应满足如下要求,流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围,能抗溶

5、剂的腐蚀，耐酸、耐碱,有较高的输送压力。一般分离,6.0,10,4,Pa,压力；高效分,离，要求达到,1.53.0,10,7,Pa,的压力或更高,泵的死体积要小，便于迅速更换溶剂和进行梯度淋洗,常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种,恒流泵,是在一定操作条件下，输出流量恒定，与,色谱柱引起阻力变化无关,恒压泵,能保持输出压力恒定，其流量随色谱系统,阻力而变化，保留时间的重现性差,目前恒流泵正逐渐取代恒压泵，恒流泵又称机械,泵，又分,机械注射泵和机械往复泵,两种，应用最多,的是,机械往复泵,梯度洗脱装置,在液相色谱中，改变流动相可以改善分离效果。因,此在分离复杂混合物时，按照一定的程序连续改变,流动

6、相的组成，可提高分离效率和加快分析速度,梯度洗脱装置就是为此目的而设置的一种装置,梯度洗脱装置有两类,低压梯度：常压下预先按一定的程序将溶剂混合后,再用泵输出色谱柱,高压梯度：将溶剂用高压泵增压后输入色谱系统梯,度混合室，加以混合后送入色谱柱,在分离过程中，使流动相的,组成、极性,pH,等,按一定程序连续变化，使样品中各组分能在,最,佳条件下,出峰，保留时间短、拥挤不堪甚至重,叠的组分和保留时间过长而峰形扁平的组分获,得很好的分离,通过逐渐改变流动相的组成增加洗脱能力,梯,度洗脱装置将两种或三种、四种溶剂按一定比,例混合进行二元或三元、四元梯度洗脱,梯度洗脱的优点,改善峰形,提高柱效,减少分析

7、时间,使强烈滞留的组分不容易残留在柱上，保持良好的柱性能,但进行下次分析时，更换流动相达到平衡时间长,梯度洗脱,与气相色谱的,程序升温,十分类似，两者的目的相,同，不同的是程序升温是通过,改变柱温,而液相色谱的梯,度洗脱是,通过改变流动相的组成、极性,pH,来达到改变,k,的目的,在高效液相色谱中，常用的进样方式,高压阀进样,优点是能用于高压，适于大体积进样，重现性,好；缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样，不同的进样,量需用不同的,定量管,同时峰的扩展也比注射进样大,微量注射器进样,也可由微量注射器注入取样环少量样品,即采用较大体积取样环而进少量试样，进样量由注射器控,制，试样不充满取样环，只

8、填充一部分体积,2,进样系统,3,分离系统,色谱柱,色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固,定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及,内衬光滑的聚合材料的其它金属。玻璃管耐压有限,故金属管用得较多。一般色谱柱长,1530,cm,内径,为,45,mm,凝胶色谱柱内径,312,mm,制备柱内径,较大，可达,25,mm,以上,固定相,表面多孔固定相,全多孔微粒固定相,直径,210,m,孔径,2100,nm,比表面积,x00,x0m,2,g,现在最广泛采用的填料是全多孔微粒硅胶,12,m,直径,1025,m,化学键合固定相,化学键合相色谱柱,虽然可将固定液机械地涂附在上述表面多孔硅胶或,全多孔

9、硅胶上作固定相，但有许多缺点，因此现在多,采用化学键合固定相,化学键合固定相是在表面多孔,或全多孔硅胶表面上利用化学反应法通过化学键把有,机分子结合在载体表面,键合类型,疏水基团：如,C,8,C,18,极性基团,如丙氨基,C,3,H,6,NH,2,氰乙基,C,2,H,4,CN,离子交换基团，如阴离子交换,NR,3,Cl,阳离子,SO,3,H,；键合途径,Si,O,C,键型,Si,O,Si,C,键型,最常用,Si,C,键型,Si-OH,ROH,Si-O-R,H,2,O,Si-OH,R,3,SiCl,Si-O-SiR,3,HCl,Si-OH,SOCl,2,Si-Cl,SO,2,HCl,Si-R(+

10、MgCl,2,RMgCl,o,煤油,H,2,OCH,3,CNCH,3,OH,流动相,正相色谱,极性：流动相,固定相,反相色谱,极性：流动相,固定相,a,流动相纯度要高，与,固定相不相溶,不发生,化学反应,b,价格便宜，毒性小，易于纯化,c,对试样溶解度适宜，不发生沉淀,d,粘度小,e,与检测器匹配,极性顺序：水,乙腈,甲醇,四氢呋喃,环己烷,煤油,4,检测系统,在液相色谱中，有两种基本类型的检测器,溶质性检测器：仅对被分离组分的物理或化学特性,有响应，有紫外,UVD,荧光,FD,二极管阵列检测器,DAD,等,总体检测器：对试样和洗脱液总的物理或化学性质,有响应，有示差折光检测器,RID,电化学

11、检测器,ECD,蒸发光散射检测器,ELSD,和质谱检测器,MSD,等,P65,表,4-3,药典中的液相色谱检测器,常用的检测器,1,紫外光度检测器,是一种选择性浓度检测器，仅,对那些在紫外波长有吸收的物质有响应,作用原理：基于待测试样对特定波长的紫外光有选择,性的吸收，试样浓度与吸光度的关系服从比尔定律,结构,1,低压汞灯,2,透镜,3,遮光板,4,测量池,5,参比池,6,紫外滤光片,7,双紫外光敏电阻,现在多数采用氘灯作为紫外光源,灯,流动池,光电二极管,R,S,样品入口,Hg 254,Zn 214,Cd 229,D2,可变,UV,检测,器,To amplifier,优点：灵敏度高（最小检测

12、度,10,9,g/mL,，对温度和,流速不敏感，可用于,梯度洗脱,缺点：只能用于对紫外光有吸收组分的测定，溶剂的选,择受限制,在高效液相色谱中应用最广，约占,70,适于梯度,洗脱，对流动相速度变化不敏感，流动相组成的变化对,检测器响应几乎无影响,对于在紫外,可见光区无强吸收的组分，需要经过衍,生化，才可以用紫外检测器，如糖类、氨基酸、类脂化,物,不能用在紫外,可见光有吸收的溶剂作流动相,溶,剂,透过波长下限,溶,剂,透过波长下限,水,180,n,庚烷,197,甲醇,210,环乙胺,200,n,丙醇二酸,205,四氯化碳,265,乙腈,190,氯仿,245,THF,230,苯,280,丙酮,33

13、0,甲苯,285,乙酸甲酯,260,二氯甲烷,232,乙酸乙酯,260,四氯乙烯,280,硝基甲烷,380,1,2,二氯乙烷,225,常用溶剂透过波长限,2,光二极管阵列检测器,是一种更为先进的检测器。从氘灯辐射通过移动,部件（光闸），直接通过吸收池、狭缝、光栅，分,光后分别照射约千个二极管阵列检测器上，约,10,ms,给出一次信号，保证保留时间极短的色谱组分的,光谱图不失真。因此数据重现性好，灵敏度高，适,于痕量分析,P,66,图,4.10,所示,光电二极管阵列,检测,器,氘灯,棱镜,池子,全息光栅,二极管阵列,512 Diodes,190,950 nm,优点,获得吸收值是保留时间和波长函数

14、的类似于等,高线的三维图；由于获得多种信息，使每一个组分在,整个波长范围内的光谱信息大大增加，及时得出每一,组分的色谱图相应的光谱数据，确定最佳选择性和灵,敏度的波长；可以与色谱工作站联用，对每一个峰从,程序库中进行检索来确定该化合物,例如：菲的三维谱图如下,荧光检测器,是利用某些试样具有荧光特性来检验的。许多有机化合物,具有天然荧光活性，其中带有芳香基团的化合物具有荧,光活性很强。一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比,荧光检测器是一种选择性检测器，适合于含有,共轭体系,的大分子、结构复杂的化合物，如稠环芳烃、甾族化合,物、酶、氨基酸、维生素、色素、蛋白质等物质的测定,最小检测限可达,10,1

15、1,10,13,g,可以用,梯度洗脱,4,示差折光检测器,是一种中等灵敏度,10,6,g /mL,的通用型检测器,是利用纯流动相和含有待测组分的流动相之间折射率的,差别进行检测的,可分为三类,反射式；折射式（偏振式）和干涉式,常,用前两种,优点：灵敏度适宜，操作简便是一种通用型的检测器,缺点：对温度变化敏感,不能用于梯度洗脱,应用范围：聚合物,糖。还用于分析以紫外检测和荧光,检测器无法检测的样品,5,蒸发光散射检测器,ELSD,结构,光源,检测器,雾化,散射光,蒸发,柱,检测,HPLC,N,2,ELSD,是,90,年代研制的，是,利用在一定条件下粒子的数量不变,光散射强度正比于,由溶质浓度决定

16、的粒子的大小而进行测量的,ELSD,原理是,基于光线通过微小的粒子时产生光散射现象,由色,谱柱分离的组分随流动相进入雾化器中被高速的载气流（氮气或空,气）喷成一种薄雾，进入蒸发器后蒸发成蒸气，再被,光阱,捕集，以,防止反射,蒸气态的溶剂,通过光路后，光线反射到检测器后被记录,成,基线,云雾状溶质颗粒,通过光路时，使光线散射后被光电倍增管,收集得到,样品信号,ELSD,是示差折光检测器的新型替代品，样品主要用于不产生荧,光和又无紫外吸收的有机物如糖类、高级脂肪酸、磷脂、甘油三酯,维生素、甾类皂苷等物质的测定。对梯度洗脱和流动相系统温度变,化不敏感,可用于梯度洗脱,ELSD,的优缺点,通用性强，灵

17、敏度高,对流动相系统温度变化不敏感，可进行梯度洗脱,响应因子具有一致性。响应值仅取决于光束中溶质颗粒的大小,和数量，检测器对有的物质几乎具有相同的响应因子,可消除流动相和杂质的干扰，提高分辩率。用于磷脂、皂甙,糖、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸收系数小的化合物检测,便于应用质谱分析。因为蒸发光散射质量检测器与质谱条件的,要求是一致的,受样品组分和流动相挥发性因素限制。要求样品组分应是非挥,发性或半挥发性的，而流动相应是挥发性溶剂,对某些样品线性范围窄，有时不呈现线性关系，定量分析复杂,电化学检测器,安培检测器,由三电极系统与恒电位仪相连接。工作电极为玻璃或石墨电极,辅助电极是铂丝；从柱后流出

18、物进入反应池，在工作电极表面发生氧,化或还原反应，两电极之间有电流通过，电流大小与被测物浓度成正,比。只能检测电化学活性物质。该检测器选择性好，灵敏度高。如,对肾上腺素和去甲肾上腺素，检测限达,10,12,g,极谱检测器,基于被测组分可在电极上发生氧化还原反应而设计的一种检测器。可用,于测定具有极谱活性的物质，如药物、维生素、有机酸、苯胺等。它,的灵敏度高，适于痕量分析,电导检测器,主要用于离子色谱。原理是基于物质在某些介质中电离后所产,生电导变化来测定电离物质的含量。电导检测器对,pH,7,时不够灵敏,受温度影响较大,P,65,表,6-3,5,附属系统,包括脱气、梯度洗脱、恒温、自动进样、馏分收集以,及数据处理等装置。其中,脱气和梯度洗脱装置,是高压,液相色谱仪中尤为重要的附属装置,脱气的目的,是为了防止流动相从高压柱内流出,释,放出气泡进入检测器而使噪声剧增，甚至不能正常检,测,溶解在溶剂中的气体进入色谱柱时，可能与流动,相或固定相发生化学反应；溶解气体还会引起某样品,的氧化降解，带来误差