反义寡核苷酸化学修饰酶类药物的研究进展

1、反义寡核苷酸化学修饰酶类药物的研究进展 关键词：化学修饰,靶向技术,序列选择,靶向转运摘要： 反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucletide,as ODN）类药物是人工合成并经化学修饰的寡核苷酸（ODN）片段，能通过自身设计的特定序列与靶 mRNA结合，在基因水平干扰致病蛋白的产生。由于其高度的选择性和较低的副作用，asODN类药物已成为近年来药物研究和开发的热点。最近，as -ODN类药物福米韦生（fomivirsen,Vitravene）通过美国FDA批准为第一个进入市场的反义药物。其他asODN类药物ISIS2302，ISIS3521CGP64128A和 G31

2、39等在临床试验中也表现出良好的疗效。 asODN作为基因表达的反向抑制剂，首先必须具备三个主要条件：即它应有足够的稳定性、对目的基因的选择性以及对细胞的通透性和靶向性。满足三个首要条件的方法主要是针对ODN在化学修饰、序列选择、靶向转运等方面加以改善。 反义寡核苷酸的化学修饰 不经修饰的ODN不论在体液内还是细胞中都极易被降解，不能发挥其反义作用。因而采用经化学修饰的ODN，以减少核酸酶对ODN的降解。对ODN化学修饰的方法主要针对三方面，即碱基修饰、核糖修饰和磷酸二酯键修饰。碱基修饰主要为杂环修饰、5-甲基胞嘧啶和二氨基嘌呤；核糖修饰主要为己糖。2O-甲基取代核糖、环戊烷、构象核糖；磷酸二

3、酯键修饰主要为硫代和甲基代修饰等。 其中硫代寡核苷酸（phosphorothioate，PSODN）、混合骨架寡核苷酸（mixed backbone oligonucleic acid， MBO）和多肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）应用广泛，成为具有代表性的第一、二、三代ODN。 硫代寡核苷酸 由于磷酸二酯键是核酶的主要靶点，因此采用硫化试剂将ODN磷酸二酯键硫化成为PS-ODN类结构，是增强ODN稳定性的有效途忡。PS ODN是迄今研究最深入、应用最广泛的一类as ODN。作为第一代as-ODN药物，PSODN只有良好的水溶性、稳定性及易于大量合成，基本能满足临床治

4、疗的需要。与天然OON相比，PSODN通过细胞内吞作用进入细胞内平衡所需时间更长，最终细胞内浓度也更高；其t1/2一般都大于24h，极大地提高了对核酸酶的耐受能力。PSODN抑制基因的表达通过两种方式，即诱导Rase H以降解目的 mRN或与目的mRNA形成杂交体而干扰mRNA的加工和翻译。其副作用主要来自其携带的负电荷和免疫原性：由于PSODN带有大量的负电佝，能与多种因子结合从而导致非特异效应。体外实验表明， PSODN及其核酸降解物能与血清蛋白、细胞表向受体结合，或者进入细胞内与某些碱性蛋白质或酶结合，产生非特异效应。另外研究还发现，PS-ODN 及其核酸降解物中含有多个连续的胞苷磷酸鸟

5、苷（CgG）序列，会产生非序列特异性的抑制作用。 混合骨架寡核苷酸 MBO是人们根据不同修饰的OON特性而加以各种组合设计而成。与PS-ODN相比，MBO通过不同化学修饰的组合降低了硫代磷酸二酯键的数量，减少了自身携带的负电荷，降低了体内降解速度并改变了核酸降解物的种类，从而减少了由硫代导致的副反应；提高了与靶mRNA的结合能力并提高诱导RNaseH降解mRNA的能力。Zhang 等在大鼠试验中，静脉给药后MBO在多种组织中均有分布，给药48h后主要仍以完整的形式存在；比对照的PS-ODN在体内的稳定性、体内各组织的分布、代谢等方面均有提高；仍观察到一些轻微副作用，如部分酶原凝血时间延长、淋巴

6、细胞增殖、有浓度依赖的补体溶血作用等，但程度要小于相同剂量的PS-ODN。 多肽核酸 PNA结构上是以2-氨基乙基甘氨酸为基本单元，碱基通过一个甲基联基与类肽链骨架相连。由于结构PNA与DNA类似，其两相邻碱基间距及碱基与类肽链骨架间的距离均相近， PNA与DNA以及RNA与PNA之间均可形成Wat son-Crick配对。体外试验证明，PNA与RNA结合 可抑制逆转录过程，与双链DNA发生链侵入反应后，可有效阻断限制性内切酶对酶切位点的识别和切割，从而阻断蛋白的表达。与前两代as-ODN相比，PNA具有更强的亲和力及更好的特异性，往往更短的片段即可获得相同的反义效果；具有良好的蛋白酶和核酸酶

7、抗性，在细胞培养液及体内不易降解，半衰期更长；经修饰后具有良好的细胞膜穿透性，其应用前景广阔。 反义寡核苷酸的序列选择 as-ODN必须与靶mRNA互相结合形成杂交分子才能发挥对目的基因的反向抑制作用，因而as ODN与其靶mRNA结合的亲和力成为其发挥反义效力的首要因素。从理论上讲，与mRNA互补的 ODN序列越长，其结合能力越强。但事实上，较长的ODN难以通透细胞膜并极易被降解，无法发挥反义作用。而且，体内的mRNA分子结构上具有高度的分子折叠，并含有大量结合的偶联蛋白，人们很难预测那些未理藏起来易于as-ODN接近的序列。 对于体内mRNA结构的复杂性，人们在as-ODN 靶序列的选择上

8、通常选择一些优先序列：例如选择启动子编码区附近或翻译起始区作为靶序列；在原核生物中，针对SD（Shine-Dalgarno）序列及其附近区域的阶as-ODN更有效；在真核生物中，针对5端非编码区可能比针对编码区的as-ODN更有效。 如果在优先区域选择靶序列不能成功，或者其他区域的选择更有价值，则需采用其他的方法确定靶序列：例如Bacon等采用Walk法确定敏感序列，从5端到3端合成一系列ODN，然后检验其反义能力，这种方法是有效的，但是人力物力投资巨大；Milner等在合成系列ODN基础上，检测它们与兔-球蛋白mRNA形成异二聚体的能力，方法简单，但由于mRNA的折叠在体内和体外有很大不同，

9、其实用价值还有待于进一步的体内验证；Ho 等采用半随机化ODN文库，探索具有RNaseH作用部位的候选mRNA靶序列，对ODN序列进行有效预计，结果与体内试验有很好的相关性。 反义寡核苷酸的靶向转运 as-ODN发挥其反义作用，必须在细胞内靶 mRNA结合部位达到有效浓度。而as-ODN一般是多阴离子化合物，大多经过多种吞噬方式进入细胞发挥其反义作用。由于这是一种耗能过程，并且转运具有饱和性，要用很高的浓度才能在细胞水平观察到对目的基因的明显抑制作用。较低的细胞通透性使as-ODN很难在靶细胞内达到治疗所需浓度。许多研究者针对as-ODN研制出多种良好的靶向转运系统以提高as-ODN的摄取速率

10、和转运特异性，极大的改善了as-ODN的细胞通透性和靶向性。 脂质体介导的靶向转运 将as-ODN包埋于脂质体中是提高其细胞通透性的有效方法。目前，采用较多的为阳离子脂质体。当as-ODN被包裹于双层结构的脂质体中时，首先减少了机体对药物的生物转化以及核酶的攻击，增加到达靶细胞的有效浓度。脂质体自身带有的正电荷使其更容易粘附于带有负电荷的动物细胞表面，脂质尾则使其易于通过细胞膜的脂质双层。 应用这种转运系统应用的最大问题是脂质体对 as-ODN的包裹效率极低，一般只有23。如果增加脂质体的体积以提高包封率，反而会降低靶细胞对脂质体的摄取，并会降低复合物在血液中被动转运的效率。增加脂质体包裹效率

11、的方法包括在脂质体复合物内引入融合基因蛋白或其他轭合物（如胆固醇等。Zelphati等将as-ODN的3端通过二硫键与胆固醇连接后，发现修饰的as-ODN与脂质体的结合能力提高了10倍，并且不影响其本身的反义效力，研究表明，与胆固醇偶联是提高as-ODN脂质体包封率的有效途径。 免疫介导的靶向转运 免疫介导主要包括受体-配体介导和抗体-抗原介导。这种靶向转运系统是指当as-ODN作用的靶细胞或组织含有一些专一性受体或抗原时，将其配体或抗体与ODN分子连接，经过特定的免疫识别作用使得as-ODN在靶细胞膜上某些特定区域富集，再通过细胞的胞吞作用实现药物向细胞内的转运。因此，免疫介导不仅大大增强了

12、对靶细胞的专一性，而且通过免疫结合使as-ODN进入细胞的转移效率也大为提高。 免疫介导的靶向转运大致可分为两种类型：（1）针对靶向的机体组织器官所特有的受体或抗原进行免疫介导，如哺乳动物肝细胞存在特有的无唾液酸糖蛋白受体，通过此受体的免疫介导可将as-ODN特异导向肝脏以治疗肝炎等疾病；（2）针对靶向的致病细胞表达的大量受体或抗原进行的免疫介导，如上皮细胞瘤表达过量的上皮生长因于受体，可以用来导入治疗剂进入肿瘤细胞发挥作用。 实际研究中常将免疫介导与脂质体介导两种方法结合使用，利用免疫脂质体为载体以特异转运as- ODN。Renneisen等研究了作用于T细胞受体 CD3分子的免疫脂质体包埋

13、的as-ODN对HIV增殖的影响。结果发现，免疫脂质体包埋的as-ODN可有效抑制HIV的增殖，而仅用脂质体包埋或游离的as- ODN对HIV没有活性。以免疫脂质体为载体的靶向给药方式可能是将来对病毒、肿瘤实施靶向治疗的理想方法之一。 毫微粒技术的应用 毫微粒是一种极小的颗粒，能携带药物分布全身，直至到达太狭窄的不能通过的部位为止。毫微粒技术利用机体内毛细血管直径随器官不同和特异部位不同而异的特点，通过部位特异的毛细血管诱捕毫微粒而实现特异性转运。Schwab等合成了 150220nm的毫微粒以吸附一段作用于点突变基因Haras mRNA的as-ODN，研究结果表明，这种毫微粒可有效地抑制Ha-ras基因的表达，所需浓度仅为游离as-ODN的1，进一步的体内试验还证明该化合物可以抑制裸鼠身上Haras基因依赖性肿瘤的生长。 结语 as-ODN作为一种新型的基因治疗药物，在心血管疾病、肿瘤、感染和炎症等多种疾病的治疗上均可得到广泛应用。随着研究的深入，as-