《生化反应曲线》PPT课件

1、生化反应曲线,生化分析基本原理,生化反应曲线,内容概况,罗氏生化分析系统产品线,Cobas 6000 (c501) 600T/H,Modular D 2400T/H,Modular P 800T/H,Cobas c311 300T/H,Cobas c111 180T/H,Cobas 8000 2000T/H,cobas 8000 模块化组合分析系统 智能、高效、强劲,物质对光吸收的基本定律 Lambert- Beer定律,LambertBeer定律表达为: 当一束平行的单色光通过含有均匀吸光物质的溶液时,溶液的吸光度(A)与溶液的浓度(C)和光透过液层厚度(L)的乘积成正比。物质对光吸收的吸光

2、系数（e）为常数。 其数学表达式：A = e*C*L,I,入射光,透射光,I0,光吸收的基本定律,light detector,根据Lambert- Beer定律来计算待测物浓度 如若吸光系数 ( )未知，我们就需要采用定标曲线 来计算待测物的浓度,Concx = Absx x Concs Abss Concx = 待测样本浓度 Concs = 标准品浓度 Absx = 样本吸光度 Abss = 标准品吸光度,此值为定值,Lambert-Beer 定律 适合于任何均匀非散射的介质,生化比色分析,特定蛋白透射比浊分析,Lambert-Beer 定律,分光光度法定量分析的依据,Roche Hita

3、chi Photometer,当相应的比色杯每一次通过光路系统时，光路系统会测量并记录下相应的吸光度 光路系统可以测量后分光后12个波长的相应吸光度。 12 有效波长: 340, 376, 415, 450, 480, 505, 546, 570, 600, 660, 700, 800nm 多数检测项目都使用双波长检测方法。（可去除干扰物对检测结果的影响,Reaction sequence,仪器读数的原理,不同仪器每个循环周期的时间间隔 Modular P 18秒 Cobas c702 16秒 Cobas C501 8秒 Modular D 12秒 C311 12秒,反应转盘不停的周期旋转,当

4、相应的比色杯通过光路系统时，光路系统会测量并记录下相应的吸光度,在不同的时间点加入相应的反应试剂,Reaction sequence,Instrument cycle,Endpoint and rate (kinetic) assays,自动生化分析常用的方法有,终点法（End Point Assays）：一般在整个反应完成后再来检测吸光度 速率法（Rate assays） ：一般在反应的过程中监测吸光度的变化情况,终点分析法,时间,吸光度,A 1,t,S+R1,基于 被测物质在反应过程中到达反应终点或平衡点，根据该点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法,终点法的计算： 从时间-吸光度曲线来

5、看，到达反应终点时，吸光度将不再变化。在达到终点时任取一点进行测定，此时底物和产物的量都不再变化,吸光度,A 1,S+R1,吸光度,两点终点法（2-point end） 一点终点法 （1-point end） 一点终点单试剂（1-point endpoint assay one reagent） 一点终点双试剂（1-point endpoint assay two reagents） 三点终点法（3-point end,终点分析法（Endpoint assays,两点终点法,在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果

6、,去除了样本的本底 采用两个测量点 针对两个或多个试剂的项目 第一个读数点一般选在添加最后一个试剂之前 第二个读数点一般选在加入最后一个试剂之后且已经达到了反应终点,两点终点法的特点,Endpoint assays,两点终点法的反应曲线Cobas c702,Endpoint assays,Sample+R1,Mp1 abs before addition of R3,Mp2 abs at reaction end,两点读数的时间点: 第19点测量包含了样本和试剂1的本底 sample + reagent 1 第 38点在加入所有试剂后，反应达到终点 sample + reagent 1+ re

7、agent 2,两点终点法的应用参数 Cobas c702,2Point Endpoint assay application settings,RF-II C4 C3 ASL CRPL IGG IGA IGM,两点终点法分析项目举例,Endpoint assays,一点终点法,A单试剂一点终点法 例如:CHOL/TG,在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，用于计算结果,B双试剂一点终点法 Mg(双试剂,单试剂一点终点法的特点（1-point endpoint assay one reagent） 不包含样本的本底 仅进行一个点的测量 检测项目举例：甘油三

8、酯（TG,Endpoint assays,单试剂一点终点法的反应曲线1-point endpoint assay one reagents,Endpoint assays,不包含样本的本底 仅进行一点测量 应用项目举例： Magnesium 不采用两点终点法主要是样本和R1体积相加仍180uL(最小反应体积，无法测量,双试剂一点终点法的特点（1-point endpoint assay two reagents,1st entry: 方法类型 2nd entry:总分析时间 3rd - 6th entry:测量点,一点终点法应用参数（1 Point Endpoint assay,Utility

9、 - Application - Analyze,TRIGL CHO,一点终点法分析项目举例,Endpoint assays,例如,多项同测组合试剂盒,CHO与TG同一测定,即双终点法,在一个通道内一次进行两项反应相关的终点法测定,三点终点法,上升 increasing 或 下降decreasing,终点法反应的方向（Reaction Direction,速率法,吸光度,t,t2,t1,t3,t4,A1,A2,A3,S+R,时间,A 1,利用线性反应期，计算出单位时间的吸光度变化A/min，来计算酶的活性,单位时间的吸光度变化量是一致的,在酶促反应过程中,在反应速度恒定期(线性反应期)来连续观

10、察和记录一定 反应时间内底物或代谢产物变化速度的化学方法,速率A法 （Rate A） 两点速率法（2-point Rate,速率法（Endpoint assays,速率A法,A 单试剂速率法 例如:ACPAFU,B 双试剂速率法 例如:ALTASTCK,在较长的反应时间区段内,每隔一定时间读取一次吸光度值,至少读取4点,得到3个A,求出单位时间的反应速率 A/min . 通过最小二乘法（least squares method,Rate A assay Modular P,Reag. at R3 timing,Rate assays,GOT/ASTGGT GPT/ ALT Lipase ALP

11、GLDH AmylaseLDH CHE CKMB,速率A 法-分析项目举例,Rate assays,2点速率法,2点速率法,尿素氮,指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦 非终点吸光度，这两点的单位时间吸光度差值用于结果计算,2-point Rate assay,Rate assays,Enzyme,采用一种或多种试剂 检测两个测量点检测固定的间隔时间内两点的吸光度变化。 换算成 Abs/min参与计算 在加入最后最后一个试剂之后进行吸光度检测,两点速率法的特点2-point Rate assay,Rate assays,2-point Rate assay Modu

12、lar P,Rate assays,Ammonia Acid phosphataseNon-prostatic phosphatase Urinary/CSF protein Bicarbonate Urea,Rate assays,2点速率 法-分析项目举例,Reaction Direction,上升decreasing 或 下降increasing,生化反应曲线,Thank you for your attention,Roche Diagnostics (Shanghai) Limited Shanghai 200031 China,This presentation is our intellectual prope