微生物的生长及其控制.ppt

1、第五章 微生物的生长及其控制,第一节 微生物生长 1 微生物生长的概念 2 微生物生长量的测定 3 微生物群体生长的规律 第二节 影响微生物生长的因素 1 物理因素对微生物生长的影响 2 化学因素对微生物生长的影响 第三节 微生物生长的控制 1.控制微生物生长的物理方法 2.控制微生物生长的化学方法,第一节 微生物生长 1 微生物生长的概念 微生物在适宜的外界环境条件下，不断地吸收营养物质，并按自身的代谢方式进行新陈代谢，如同化作用大于异化作用，其结果是原生质的总量（包括重量、体积、大小）不断地增加，称为微生物的生长现象。生长定义为微生物细胞在群体水平上增加，也可以认为是微生物群体数量增加。许

2、多微生物是以二分裂的方式生长的。一般细胞分裂和染色体复制是协调控制的。 单细胞微生物如细菌的生长，往往伴随着细胞数目的增加。当细胞增长到一定程度时，就以二分裂方式，形成两个相似的子细胞，子细胞又重复上述过程，使细胞数目增加，称为繁殖。在多细胞微生物中，例如某些霉菌，细胞数目的增加如不伴随着个体数目的增加，只能叫生长，不能叫繁殖。例如菌丝细胞的不断延长或分裂产生同类细胞均属生长，只有通过形成无性孢子或有性孢子使得个体数目增加的过程才叫做繁殖,在一般情况下，当环境条件适合，生长与繁殖始终是交替进行的。从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程，这个过程就是发育。 生长是细胞逐步发生的量变过程， 繁殖是产

3、生新的细胞个体的质变过程，伴随着细胞总数的增加。 个体生长 个体繁殖 群体生长 群体生长=个体生长+个体繁殖 微生物特别是单细胞微生物，体积很小，个体生长很难测定，意义也不大。通常测定微生物的生长是测群体的生长，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。 测生长量的方法如下： 测定生长量的方法有许多种，适用于一切微生物,2 生长量的测定： 一、直接法 1测体积 它是一种较为粗放的方法，例如将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心，然后观察沉降物的体积。 2称干重 采用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的1020%。如用离心法，将待测培养液离心，再用清水洗涤离心15次后干燥，可用1

4、05、100或红外线烘干，也可在较低的温度（80或40）下进行真空干燥，然后称干重。如细菌一个细胞一般重10-1210-13g。如为丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜进行过滤。过滤后，细胞可用少量水洗涤，再真空干燥（40以下），称干重。以乳酸菌为例，在液体培养基中，细胞的浓度大约为2108个/ ml。100 ml培养物可得1070mg干重的细胞。 二、间接法 1、生理指标法 与生长量相平行的生理指标很多，它们均可用作生长测定的相对值。 （1） 测定细胞总含氮量来确定细菌浓度 大多数细菌的含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%。总氮量与细胞粗蛋白的含量（因其中包括

5、了杂环氮和氧化型氮）的关系可用下式计算： 粗蛋白总量=含氮量%6.25,含氮量的测定方法有很多，常用凯氏定氮法。此法适用于细胞浓度较高的样品，同时操作过程也较麻烦，主要用于科学研究中。 （2）含碳量的测定 微生物新陈代谢的结果，必然要消耗或产生一定量的物质，以表示微生物的生长量。一般生长旺盛时消耗的物质就多，或者积累的某种代谢产物也多。将少量生物材料混入1ml水或无机缓冲液中，用2ml2%重铬酸钾溶液在100下加热30分钟，冷却后，加水稀释至5ml，在580nm波长下测定光密度值（用试剂作空白对照，并用标准样品作标准曲线），即可推算出生长量。 （3）其它 磷、DNA、RNA、ATP和 N乙酰胞

6、壁酸等的含量，以及产酸、产气、产CO2（用标记葡萄糖作基质）、耗氧、粘度和产热等指标，均可用于生长量的测定。 2、比浊法 微生物在液体培养基中生长，由于原生质含量的增加，引起培养物混浊度的增高。最古老的比浊法是采用McFarland比浊管，用不同浓度的Bacl2与稀H2SO4配制成的10支试管，其中形成的BaSO4有10个梯度，表示10个相对的细菌浓度（预先用相应的细菌测定）。某一未知浓度的菌液在透射光下用肉眼与某一比浊管进行比较，如果两者的浊度相当，即可目测出该菌液的大致浓度。 精确的测定，要用分光光度计进行。在可见光的450650nm波长内均可测定,三、计数法 计数法即是计算微生物繁殖出的

7、个体数目，此法适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子。 （一）直接法 直接法即是在显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法，其计数结果是包括死细胞在内的总菌数。 1、比例计数法 是一种粗放的计数方法。将已知颗粒（例如霉菌的孢子或红细胞等）浓度的液体与待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，然后镜检各自的数目，求出未知菌液中的细胞浓度。 2、血球计数板法 计数一定容积中的细胞总数的常用方法，此法对细胞较大的酵母菌较为适用。详细方法见实验指导书。 （二）间接法 是一种活菌计数法，其原理是活菌在液体培养基中生长繁殖使液体混浊，在固体培养基表面形成菌落，然后计数活菌的方法。 1、平板菌落计数法 是

8、一种常用的食品中细菌总数的计数法，有标准方法将待测样品稀释，然后取适宜的稀释度样品与固体培养基混匀，凝固后培养，然后计数平板上出现的菌落数乘以样品的稀释度，即可计算出样品的含菌数。也可用涂布法将稀释样品接种在凝固的平板培养基上，后续方法同前。此法的优点是检测的结果较为精确，缺点是方法烦琐，获得检测结果的时间长,血球计数板方法,计数的方法,GB方法 培养的温度、时间严格 生长的特殊性,要求计数范围在30300之间的菌落，当大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘上稀释倍数 呈片状生长的菌落超过培养皿的一半不能计数 当其两个稀释度都在30-300间，二者的比值大于2时，以其中小

9、的数报告 当其两个稀释度的比值小于或等于2时，以应报告其平均数,2、液体稀释法 对未知样品作10倍系列稀释。选适宜的3个连续的10倍稀释液各取3ml，接种到3组共9支液体培养基试管中，每管接入1ml，培养一定的时间后，记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查MPN（most probable number ，最近似数）表，根据样品的稀释倍数可计算出其中的活菌含量。 3、细胞混浊度的测定 估计细胞数目和粗重的一较快和适用的方法是使用混浊度测定法。一个细胞悬浮液用肉眼观察是呈现浑浊的，这时因为光线通过悬浮液时，细胞散射光线。存在的细胞数越多，分散的光线就越多，因此悬浮液浊度就越大。可以用光度计或分光

10、光度计测量混浊度，分光光度计和光度计射出的光线通过细胞悬浮液时，就可以检测出没有被细胞散射的光线,3 微生物群体生长的规律,微生物的群体生长规律 单细胞的微生物，如细菌、放线菌在液体培养基中，可以均匀地分布，每个细胞接触的环境条件相同，都有充分的营养物质，故每个细胞都迅速地生长繁殖。霉菌多数是多细胞微生物，菌体呈丝状，在液体培养基中生长繁殖的情况与单细胞微生物不一样，如果采取摇床培养，则霉菌在液体培养中的生长繁殖情况，近似于单细胞微生物。因液体被搅动，菌丝处于分布比较均匀的状态，而且菌丝在生长繁殖过程中不会像在固体培养基上那样有分化现象，孢子产生也较少。 （1）典型的生长曲线 微生物生长繁殖的

11、速度非常快，一般细菌在适宜的条件下，大约2030分钟就可以分裂一次，如果不断迅速地分裂，短时间内可达惊人的数目，但实际上是不可能的,在培养条件保持稳定的状况下，定时取样测定培养液中微生物的菌体数目，发现在培养的开始阶段，菌体数目并不增加，一定时间后，菌体数目就增长很快，继而菌体数目增长速度保持稳定，最后增长速度逐渐下降以致等于零。如果以培养时间为横坐标，以单细胞增长数目的对数值作纵坐标，就可作出一条生长曲线。这生长曲线（growth curve）代表单细胞微生物从生长开始到衰老死亡的一般规律。 根据微生物的生长速率常数（growth rate constant），即每小时的分裂代数的不同，一般

12、把典型的生长曲线粗分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期。 （一） 延滞期（lag phase） 又叫适应期、缓慢期或调整期，是指把少量微生物接种到新培养液刚开始的一段时间细胞数目不增加的时期，甚至细胞数目还可能减少。延滞期有如下特点：（1）生长的速率常数为零。（2）细胞的体积增大，DNA、含量增多为分裂做准备。（3）合成代谢旺盛，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。（4）对不良环境敏感，例如pH、NaCl溶液浓度、温度和抗生素等化学物质,发酵工业中常常要采取措施缩短延滞期，其方法主要有： （1）以对数期的菌体作种子菌， （2）适当增大接种量，生产上接种量的多少是影响延滞期的一个

13、重要因素 ，接种量大，延滞期短，接种量小，则延滞期长。一般采用38%的接种量，最高不超过1/10。 （3）培养基的成分 为了缩短培养基的营养成分差异，常常在种子培养基中加入生产培养基的某些营养成分，即是种子培养基尽量接近发酵培养基。 （二）对数期（logarithmic phase） 又叫指数期，指在生长曲线中，紧接着延滞期后的一段时期。此时菌体细胞生长的速率常数R最大，分裂快，细胞每分裂繁殖一次的增代时间（即代时，generation time）短，细胞进行平衡生长，菌体内酶系活跃，代谢旺盛，菌体数目以几何级数增加，细胞以惊人的速度产生，群体的形态与生理特征最一致，抗不良环境的能力强,图3-

14、12 生长曲线中的指数期,在对数期中，以下三个参数尤为重要。 繁殖代数（n）由生长曲线图可以得出。P134 生长速率常数（R）如前所述生长速率常数的定义的可知 。 代时（G） 如前所述平均代时的定义可知。 影响微生物对数期增代时间的因素较多，主要有： （1）菌种 ：不同微生物代时差别大，即使是同一菌种，由于培养基成分和物理条件（如培养温度、培养基的pH和营养物质的性质）的不同，其对数期的代时也不同。但是，在一定条件下，各种菌的代时是相对稳定的，多数为2030分钟，有的长达33小时，快的只有9.8分钟左右。如表4- 不同细菌的代时,2） 营养成分 同种细菌，营养丰富的培养基，其代时就短，反之则长

15、。 （3）培养温度 ：温度是影响微生物生长速率的重要物理因素。 在微生物的最适生长温度范围时，代时就短。如表-14。 表14 大肠杆菌在不同温度下的代时,三) 稳定期 （stationary phase） 一个单细胞重量约为11012g,显然，在指数生长延长到48小时之前，一定有一些物质限制了群体细胞生长，因此进入稳定期。稳定期又叫最高生长期或恒定期。处于稳定期的微生物其特点是新繁殖的细胞数与衰亡细胞数几乎相等，细胞数目没有净增加或净减少，即是正生长与负生长达动态平衡，此时生长速度逐渐趋向于零。 出现稳定期的原因主要有： （1）营养物质耗尽，营养物质的比例失调，例如C/N比值不合适等； （2）

16、酸、醇、毒素或过氧化氢等有害代谢产物的累积； （3）pH、氧化还原势等环境条件越来越不适宜等。 在稳定期虽然没有出现生长，但许多细胞功能包括能量代谢和某些生化合成过程都仍然在继续，稳定期的微生物，在数量上达到了最高水平，产物的积累也达到了高峰，这时，菌体的总产量与所消耗的营养物质之间存在着一定关系。此外，由于对稳定期到来的原因进行研究，促进了连续培养技术的产生和研究。生产上常常通过补料、调节温度和pH等措施，延长稳定期，以积累更多的代谢产物,四）衰亡期（decline phase或 death phase） 如果群体细胞达到稳定期后仍继续培养，这些细胞或许仍能维持生命和继续进行代谢，但它们也可

17、能死亡。如果出现死亡，就认为群体细胞处于衰亡期。稳定期后，微生物死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负生长”（R为负值），此阶段叫衰亡期。这时，细胞形态多样，例如产生很多膨大、不规则的退化形态；有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应为阳性的变成阴性；有的微生物因蛋白水解酶活力的增强发生自溶（autolysis）；有的微生物在这时产生抗生素等次生代谢产物；对于芽孢杆菌，芽孢释放往往也发生在这一时期,衰亡期微生物形态发生变化,酵母菌和霉菌的生长曲线,酵母菌的生长曲线：与单细胞微生物基本相似,丝状真菌的生长曲线：在液体或深层培养中，以菌丝干重作为衡量的指标，菌丝的生长

18、过程分为3个阶段：生长停滞期、迅速生长期、衰亡期，6个时期，即停滞期、指数期、线性期、减速期、稳定期、衰亡期,2）微生物的连续培养 在分批培养的指数前期，培养条件或许可以维持相对稳定，但在后期，当细胞数目变得非常大的时候，培养基的化学组成一般会发生巨大的变化。对许多研究来说，都希望能长时间地保持培养物处于一种稳定的环境中，这就可以通过使用连续培养而获得。连续培养( continuous culture )又叫开放培养( open culture )，是相对分批培养( batch culture )或密闭培养( closed culture )而言的。 连续培养是在研究典型生长曲线的基础上，认识

19、到了稳定期到来的原因，采取在培养器中不断补充新鲜营养物质，另一方面，及时不断地以同样速度排出培养物（包括菌体和代谢产物）。这样，培养物就可达动态平衡，其中的微生物可长期保持在对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率上,连续培养的方法主要有两类： 恒浊法 其原理是根据培养器内微生物的生长密度，用光电控制系统（浊度计）来检测培养液的浊度（即菌液浓度），并控制培养液的流速，从而获得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养液。在恒浊器中的微生物，始终能以最高生长速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度。 恒化法 恒化法是使培养液流速保持不变，使微生物始终在低于最高生长速率条件下进行生长繁殖的

20、一种连续培养方法。常常通过控制某一种营养物的浓度，使其成为限制性的因子，而其他营养物均为过量，这样，细菌的生长速率将取决于限制性因子的浓度。随着细菌的生长，菌体的密度会随时间的增长而增高，而限制性生长因子的浓度又会随时间的增长而降低，两者互相作用的结果，出现微生物的生长速率正好与恒速加入的新鲜培养基流速相平衡,图4- 连续培养装置结构,连续培养如用于发酵工业中，就称为连续发酵（continuous fermentation）。连续发酵与分批发酵相比有许多优点： （1）自控性，便于利用各种仪表进行自动控制；（2）高效，它使装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等工艺简化了，缩短了生产时间和提高了设备的利用

21、效率；（3）产品质量较稳定；（4）节约了大量动力、人力、水和蒸汽，使水、汽、电的负荷减少。 不足之处：（1）主要是菌种易于退化，使微生物长期处于高速繁殖的条件下，即使是自发突变率 很低，也难以避免变异的发生。（2）容易污染，在连续发酵中，要保持各种设备无渗漏，通气系统不出任何故障，是极其困难的。因此，“连续”是有时间限制的，一般可达数月至一年、两年。（3）连续培养中，营养物的利用率低于分批培养。 在发酵工业中，连续培养技术已广泛用于酵母单细胞蛋白的生产，乙醇、乳酸、丙酮和丁醇等发酵，以及用假丝酵母（Candida spp.）进行石油脱蜡或是污水处理中,由于细胞的生长差异，同步生长常常只能维持2

22、-3代，之后又逐渐转变为非同步生长,3）同步生长 在分批培养中，细菌群体以一定速率生长，但所有细胞并非同时进行分裂，即是培养中的细胞不处于同一生长阶段，它们的生理状态和代谢活动也不完全一样。要研究每个细胞所发生的变化是很困难的。为了解决这一问题，就必须设法使微生物群体处于同一发育阶段，使群体和个体行为变得一致，所有的细胞都能同时分裂，因而发展了单细胞的同步培养（synchronous culture）技术。 获得细菌同步生长的方法主要有两类： 调整生理条件诱导同步性：主要是通过控制环境条件如温度、光线和处于稳定期的培养物添加新鲜培养基等来诱导同步； 机械法（又称选择法），一般可用过滤分离法或梯

23、度离心法来达到。在这两种方法中，由于诱导法可能导致与正常细胞循环周期不同的周期变化，所以不及选择法好，这在生理学研究中尤其明显。离心方法,图4-15同步培养方法 a.膜洗脱法 b.密度剃度离心法,图-1 用Helmstetter-Cummings法获得同步生长的细菌,小测验： 一、名称解释：加富培养基 SCP 菌落 生长因子 优势菌相 二、判断正误（正确的用表示，错误的用表示） 1. 科赫是第一个看到微生物的形态的微生物学家。（） 2. 曲霉的基内菌丝分化出匍匐菌丝和假根。（） 3. 原核微生物在自发突变形成的遗传性稳定的细胞壁缺陷的菌株是原生质体。（） 4. 病毒的繁殖方式是复制。（） 5.

24、 青霉素的抗菌的机理是抑制细胞壁肽聚糖的合成。（） 6. 蓝细菌是属于化能自养型。（） 三、问答题 1. 图解微生物生长与温度的关系。 2. 图解细菌的生长曲线。 3. 绘出毛霉的形态图，标出名称,第二节 影响微生物生长的因素,影响微生物生长的外界因素很多，其一是前面讨论过的营养物质，其二是许多物理、化学因素。当环境条件的改变，在一定限度内，可引起微生物形态、生理、生长、繁殖等特征的改变；当环境条件的变化超过一定极限时，则导致微生物的死亡。研究环境条件与微生物之间的相互关系，有助于了解微生物在自然界的分布与作用，也可指导人们在食品加工中有效地控制微生物的生命活动，保证食品的安全性，延长食品的货

25、架期。无论是在自然界中，生物体之间存在相互作用，还是在实验室中纯培养的微生物之间的相互作用，环境因素都能在很大程度上影响它们的生长和代谢产物的能力，这里重点讨论其中最主要的温度、pH、水的有效利用率和氧气等几大因素,生长繁殖，积累发酵产物 环境 微生物 生长抑制、变异、死亡 食品质量控制 消毒是指杀死或消除所有病原微生物的措施，可达到防止传染病传播。 防腐指利用某些理化因子，使物体内外的微生物暂时处于不生长繁殖但又未死亡的方法。常用低温、干燥、盐腌、糖渍等方法，或加化学防腐剂于食品中防止食品腐败、变质。 灭菌是指利用一切物理或化学因子，使存在于物体内所有活的微生物，永久性地丧失其生活力，包括最

26、耐热的细菌芽孢，是一种彻底杀菌措施。 商业灭菌又叫杀菌，是从商品的需要出发对食品进行的灭菌，它是指食品经过杀菌处理后按照一定的检验方法检不出活的微生物或仅能检出极少数非病原微生物，而且它们在一定的保存期内不致 引起食品变质腐败,死亡对事物来说是不可逆的丧失了生长繁殖能力,1 物理因素对微生物生长的影响,一、温度 温度是影响微生物生长繁殖最重要的因素之一。在一定温度范围内，机体的代谢活动与生长繁殖随着温度的上升而增加，当温度上升到一定程度，开始对机体产生不利的影响，如再继续升高，则细胞功能急剧下降以至死亡。 与其他生物一样，任何微生物的生长温度尽管有高有低，但总有最低生长温度、最适生长温度和最高

27、生长温度这三个重要指标，这就是生长温度的三个基本点。如果将微生物作为一个整体来看，它的温度三基点是极其宽的，由以下可看出： 最低生长温度（一般为5 10，极端为30） 嗜冷菌 (1530 ) 生长温度三基点最适生长温度 嗜中温菌 (2045 ) 嗜热菌 ( 5565) 最高生长温度（一般为8095，极端为105300） 就总体而言，微生物生长的温度范围较广，已知的微生物在零下12100均可生长。而每一种微生物只能在一定的温度范围内生长。（图,当环境温度超过微生物生长的最高温度、或环境温度低于微生物生长的最低温度都会对微生物产生杀灭作用或抑制作用,图4-17 温度对典型的嗜冷生物、嗜温生物、嗜热

28、生物 及两种不同的嗜高温生物的生长速率之间的关系,最低生长温度 : 是指微生物能进行繁殖的最低温度界限。 最适生长温度: 是指某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。但是，同一微生物，不同的生理生化过程有着不同的最适温度，也就是说，最适生长温度并不等于生长量最高时的培养温度，也不等于发酵速度最高时的培养温度或累积代谢产物量最高时的培养温度，更不等于累积某一代谢产物量最高时的培养温度。因此，生产上要根据微生物不同生理代谢过程温度的特点，采用分段式变温培养或发酵。例如，嗜热链球菌的最适生长温度为37，最适发酵温度为47，累积产物的最适温度为37。 最高生长温度: 是指微生物生长繁殖的最高温度界

29、限。在此温度下，微生物细胞易于衰老和死亡。微生物所能适应的最高生长温度与其细胞内酶的性质有关。例如细胞色素氧化酶以及各种脱氢酶的最低破坏温度常与该菌的最高生长温度有关。 致死温度: 最高生长温度如进一步升高，便可杀死微生物。这种致死微生物的最低温度界限即为致死温度。在一定的温度下处理时间越长，死亡率越高。严格地说，一般应以10分钟为标准时间。细菌在10分钟被完全杀死的最低温度称为致死温度,表4-16不同类型微生物生长温度范围,一）低温型的微生物 又称嗜冷微生物，可在较低的温度下生长。地球表面温度大多数相当低，海洋覆盖了地球表面的一多半，平均温度为5，开放海洋的深处，恒定温度在13。常见的产碱杆

30、菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、微球菌属等常使冷藏食品腐败变质。有些肉类上的霉菌在零下10仍能生长，如芽枝霉；荧光极毛菌可在零下4生长，并造成冷冻食品变质腐败。 对于嗜冷微生物研究要非常小心，这些嗜冷性微生物如果处于室温下很短一段时间可能就会被杀死。因此，在采样、运输以及实验室接种、涂布平板等操作过程中防止温度升高。 耐冷微生物比嗜冷微生物分布广泛得多。可以从温带环境的土壤、水中、肉类、奶类制品及储藏在冰箱中的苹果汁、蔬菜中分离到。耐冷性的微生物在2040之间能很好地生长。 嗜冷的分子机制 嗜冷微生物产生的酶，一般在寒冷条件下酶活最大，在非常温和的温度下，这些酶经常就会变性或失活。嗜冷微生物与嗜温

31、微生物比较，就是在低温下能够进行主动运输，也就意味着嗜冷微生物的原生质膜构造不同于一般的微生物，即使在低温下也不能抑制膜现象发生。对嗜冷微生物细胞质膜组成成分研究表明，它们含有较高含量的不饱和脂肪酸，这些不饱和脂肪酸在低温下也能保持半流动状态。某些嗜冷菌的膜脂类组成中也含有聚不饱和脂肪酸和含有多个双键的碳氢化合物。现在已经从几种生存于南极的细菌脂类组分中鉴别出了含有9个双键的碳氢化合物。 抑制微生物的生长。在0以下，菌体内的水分冻结，生化反应无法进行而停止生长。有些微生物在冰点下就会死亡，主要原因是细胞内水分变成了冰晶，造成细胞脱水或细胞膜的物理损伤。因此，生产上常用低温保藏食品，各种食品的保

32、藏温度不同，分为寒冷温度、冷藏温度和冻藏温度,二）中温型的微生物 绝大多数微生物属于这一类。最适生长温度在2040之间，最低生长温度1020，最高生长温度4045。它们又可分为嗜室温和嗜体温性微生物。嗜体温性微生物多为人及温血动物的病原菌，它们生长的极限温度范围在1045，最适生长温度与其宿主体温相近，在3540之间，人体寄生菌为37左右。引起人和动物疾病的病原微生物、发酵工业应用的微生物菌种以及导致食品原料和成品腐败变质的微生物，都属于这一类群的微生物。因此，它与食品工业的关系密切。 (三)高温型微生物 它们适于在4550以上的温度中生长，在自然界中的分布仅局限于某些地区，如温泉、日照充足的

33、土壤表层、堆肥、发酵饲料等腐烂有机物中，如堆肥中温度可达6070。能在5570中生长的微生物有芽孢杆菌属（Bacillus）、梭状芽孢杆菌（Clostridium）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bac. stearothermophilus）高温放线菌属（Thermoactinomyces）、甲烷杆菌属（Methanobacterium）等；温泉中的细菌；其次是链球菌属和乳杆菌属。有的可在近于100的高温中生长。这类高温型的微生物，给罐头工业、发酵工业等带来了一定难度。 许多热泉温度接近沸点，蒸汽口（热泉喷气孔）温度可达150500。海洋底部热水口温度约达350或更高，但主要集中在美国西部、新西兰、冰岛

34、、日本、地中海地区、印度尼西亚和法国等地区。世界上具有最大的热泉集中区域面积就是黄石公园9293（美国,嗜热的分子机制 嗜热微生物和嗜高温微生物为什么能在那么高的温度下生长？也与这些生物中的酶和蛋白质有关，它们具有耐热性及高温下的稳定性。研究嗜热微生物中的酶发现，它们的氨基酸序列与嗜温微生物中催化相同反应的酶的氨基酸序列一般只有很小的差别，很明显，是一个关键的氨基酸代替了存在于此酶中一个或几个氨基酸，导致该酶折叠的方式不同，从而使该酶能耐热性增强。 同时高温型微生物的蛋白质合成机构核糖体和其他成分对高温抗性也较大，发现tRNA在特定的碱基对区域内含有较多的GC对，提供了较多的氢键，增加了热稳定

35、性；细胞膜中饱和脂肪酸含量高，它比不饱和脂肪酸可以形成更强的疏水键，因此可保持在高温下的稳定性并具正常功能。 （1）不同的微生物有不同的最适生长温度； （2）通常微生物的最适生长温度不一定是最适发酵温度； （3）同种微生物在不同的发酵温度条件下，发酵产物可能不同,1 低温对微生物的影响：微生物对低温具有抵抗力，绝大多数微生物所处的环境温度降低到最低生长温度时，微生物的新陈代谢活动减弱到最低程度，最后处于停滞或休眠状态。这时微生物的生命活动几乎停止，但能在较长时间内保持生命，少数要发生死亡。 芽孢、孢子 球菌 G+杆菌 低温用于食品的保藏： 寒冷温度：室温与冷藏温度之间，保藏期短，适于果蔬保藏。

36、1415。 冷藏温度：微生物的生命活动显著降低，但一些嗜冷菌可缓慢生长。适于蔬菜、 果品、鱼、肉、蛋、乳类短期保藏。0-7 。 冻藏温度： 0以下的温度，一般冻肉在-18 保藏，可在较长的时间内保藏食品。 -18 几乎可以抑制所有微生物的生长。 Orange 2-9 banana 10-11 granpe 0-1 litchi 4 Peach 05-1 longan mango 2 高温对微生物的影响： 敏感，一般超过微生物的最高生长温度，敏感的微生物就会死亡,高温致死的机理：菌体蛋白变性，同时破坏了酶的结构，酶的活性消失了，代谢也就停止了。 高温 灭菌的方法： (1)热（力致）死时间（The

37、rmal Death Time TDT） 是指在特定的条件和特定的温度下，杀死一定数量微生物所需要的时间，称热力致死时间。 (2)D值（Decimal reduction time） 在一定温度下加热，活菌数减少一个对数周期（即90%的活菌被杀死）时，所需要的时间（分），即为D值。测定D值时的加热温度，即在D的右下角表明。例如：含菌数为105 /毫升的菌悬液，在100的水浴温度中，活菌数降低至104/毫升时，所需时间为10分，该菌的D值即为10分，即D100=10分。如果加热的温度为121.1（250），其D常用Dr表示。 (3)Z值 如果在加热致死曲线中，时间降低一个对数周期（即缩短90%的

38、加热时间）所需要升高的温度（），这所需要升高的温度数，即为Z值,热力致死曲线,4)F值 在一定的基质中，其温度为121.1，加热杀死一定数量微生物所需要的时间（分），即为F值。 3 高温灭菌的方法： （1）干热灭菌法：A 火焰灭菌法：特点：速度快、灭菌彻底、效果好。应用范围：废弃物。 B 干燥加热空气灭菌法：150-160 ，1-2小时。应用范围：玻璃器皿，金属及其他干燥耐热物品的灭菌。玻璃器皿要烘干。 （2）湿热灭菌(moist heat sterilization) （A）煮沸消毒法 物品在水中100煮沸15分钟以上，可杀死细菌的营养细胞和部分芽孢，如在水中加入1%碳酸钠或25%石炭酸，则

39、效果更好。这种方法适用于注射器、解剖用具等的消毒。 （B）巴氏灭菌 (pasteurization)灭菌的温度一般在6085处理1530分钟，可以杀死微生物的营养细胞，但不能达到完全灭菌的目的，用于不适于高温灭菌的食品，如牛乳、酱腌菜类、果汁、啤酒、果酒和蜂蜜等，其主要目的是杀死其中无芽孢的病原菌（如牛奶中的结核杆菌或沙门氏杆菌），而又不影响它们的风味。 （C）超高温瞬时灭菌法 （Ultra high temperature short time,UHT）灭菌的温度在13513735秒，可杀死微生物的营养细胞和耐热性强的芽孢细菌，但污染严重的鲜乳在142以上杀菌效果才好。超高温瞬时灭菌法现广泛

40、用于各种果汁、牛乳、花生乳、酱油等液态食品的杀菌,此法的特点是既可杀灭微生物，又可最大限度减少营养成分的破坏。在发酵工业中此法用作培养基的灭菌，主要操作是将培养基在发酵罐外连续地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐，培养基一般在135140下处理515秒钟。 （D）高压蒸汽灭菌法 (normal autoclaving)高压蒸汽灭菌法是实验室和罐头工业中常用的灭菌方法。高压蒸汽灭菌是在高压蒸汽锅内进行的，锅有立式和卧式两种，原理相同，锅内蒸汽压力升高时，温度升高。一般采用9.8104Pa的压力，121.1处理1530分钟，也有采用较低温度（115）下维持30分钟左右，可达杀菌目的。罐头工业中

41、要根据食品的种类和杀菌的对象、罐装量的多少等决定杀菌式。实验室常用于培养基、各种缓冲液、玻璃器皿及工作服等灭菌。 影响高压蒸汽灭菌效果的因素： 灭菌物体含菌量的影响 ；灭菌锅内空气排除程度的影响 ；灭菌对象的体积 ， 灭菌对象体积的大小直接影响灭菌的效果，体积过大会影响热的传导速率。待灭菌的物体或培养基体积不宜过大，也不不宜在锅内塞得拥挤。 灭菌对象PH的影响 灭菌物品的PH也影响灭菌的效果。当其PH在6.08.0时，微生物的抵抗力较大，不易死亡；PH6.0时，最易引起死亡。 加热与散热速度 在高压灭菌时，常常只注意达到灭菌温度后维持时间。而实际工作中达到灭菌温度的时间有快有慢，同样灭菌完毕后

42、降温的时间也有快有慢,5）间歇灭菌法(fractional sterilization 或tyndallization) 是用流通蒸汽反复灭菌的方法，常常温度不超过100，每日一次，加热时间为30分钟，连续三次灭菌，杀死微生物的营养细胞。每次灭菌后，将灭菌的物品在（2837）培养，促使芽孢发育成为繁殖体，以便在连续灭菌中将其杀死。 100灭菌 培养 灭菌 培养 灭菌 此外在生产上消除有害微生物的方法还有： 、过滤除菌法：对不耐热的液体可采用过滤除菌法达到“灭菌”，例如：滤膜过滤装置、烧结玻璃滤板过滤器、石棉板过滤器以及硅藻土过滤器等。过滤除菌的缺点是无法去除其中的病毒和噬菌体。 、采用特殊的加

43、热灭菌法：对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后在合并；对含Ca+2或Fe+3的培养基与磷酸盐可先分别灭菌，然后再混合，这样就不易形成磷酸盐沉淀；对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（112下灭菌15分钟）或间歇灭菌；在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌,膜过滤除菌法,采用滤孔比细菌还小的滤膜、筛子作成各种过滤器，当液体、空气流经滤膜或筛子时，微生物不能通过滤孔而被阻留在一侧，从而达到除菌的目的。但病毒由于很小不能除去。 在实验室中常常采用的滤器： 滤膜过滤器、蔡氏过滤器、磁土过滤器和玻璃过滤器等。 过滤介质：硝酸纤维素

44、膜、醋酸纤维素膜、聚丙烯膜以及石棉板、烧结陶瓷、烧结玻璃等。 滤器孔径：常用0.22 m 、0.45 m 。 应用：对于含酶、糖溶液、血清等热敏物质除菌,影响微生物对热抵抗力的因素 菌种 不同微生物由于细胞结构和生物学特性不同，对热的抵抗力也不同。一般的规律是嗜热菌的抗热力大于嗜温菌和嗜冷菌，芽孢大于非芽孢菌，球菌大于非芽孢杆菌，革兰氏阳性菌大于革兰氏阴性菌，霉菌大于酵母菌，霉菌和酵母的孢子大于其菌丝体。细菌的芽孢和霉菌的菌核抗热力特别大。 菌龄 同样的条件下，对数生长期的菌体抗热力较差，而稳定期的老龄细胞较大，老龄的细菌芽孢较幼龄的细菌芽孢抗热力强。 菌体数量 菌数愈多，抗热力愈强，因加热杀

45、死最后一个微生物所需的时间也长；另外，微生物群集在一起时，受热致死不是时间而是有先有后，同时菌体能分泌一些有保护作用的蛋白质物质，菌多分泌的保护物质也多，抗热性也就强。 基质的因素 微生物的抗热力随含水量减少而增大，同一种微生物在干热环境中比在湿热环境中抗热力大；基质中的脂肪、糖、蛋白质等物质对微生物有保护作用，微生物的抗热力随这类物质的增多而增大；微生物在pH值范围是7左右，抗热力最强，pH值升高或下降都可以减少微生物的抗热力。特别是酸性环境微生物的抗热力减弱更明显。 加热的温度和时间 加热的温度越高，微生物的抗热力越弱，越容易死亡，加热的时间越长，热致死作用越大。在一定高温范围内，温度越高

46、杀死所需时间越短。另外，其他因素如盐类等，在基质中有降低水分活性作用，从而增强抗热力；而另一类盐类如钙盐、镁盐可减弱微生物对热的抵抗力,4 热力杀菌在食品工业中的应用： A 烘烤、油炸法：如面包、方便面。 B 沸水杀菌法：用于水果类罐头的杀菌。 C 巴氏杀菌：用于啤酒工业、蔬菜加工制品的杀菌。 D 高压杀菌方法：用于蛋白质含量高的罐头食品的杀菌。 F UHT灭菌：主要用于牛奶、果汁和酱油的灭菌。 5 杀菌式的制定： 确定杀菌的指标菌，再指定杀菌式,二、干燥和水的利用率 水分对维持微生物的正常生命活动是必不可少的。干燥会造成微生物失水代谢停止以至死亡。不同的微生物对干燥的抵抗力是不一样的。 芽孢

47、 霉菌和酵母菌的孢子 有荚膜的细菌 革兰氏阳性球菌和酵母的营养细胞 霉菌的菌丝。 影响微生物对干燥抵抗力的因素： 干燥时温度升高，微生物容易死亡，微生物在低温下干燥时，抵抗力强，所以，干燥后存活的微生物若处于低温下，可用于保藏菌种； 干燥的速度快，微生物抵抗力强，缓慢干燥时，微生物死亡多；微生物在真空干燥时，在加保护剂（血清、血浆、肉汤、蛋白胨、脱脂牛乳）于菌悬液中，分装在安瓿内，低温下可保持长达数年甚至10年的生命力。食品工业中常用干燥方法保藏食品。 水的利用率 ：微生物必须在水分活度较高的环境中才能生长繁殖，水是微生 物营养物质的溶剂，自然环境中含水量的多少确定微生物的种类和数量。许多 微

48、生物不能适应水活度极低的环境，因此在那些环境条件下微生物死亡或长期 休眠。 干燥在食品加工中应用：食品工业中利用自然干燥和机械干燥方法保藏食品,三、渗透压 （1）等渗溶液：大多数微生物适于在等渗的环境生长。 （2）高渗溶液：若置于高渗溶液（如20%NaCl）中，水将通过细胞膜到细胞周围的溶液中，造成细胞脱水而引起质壁分离，使细胞不能生长甚至死亡； （3）低渗溶液：若将微生物置于低渗溶液（如0.01%NaCl）或水中，外环境中的水从溶液进入细胞内引起细胞膨胀，甚至破裂致死。 一般微生物不能耐受高渗透压，因此，食品工业中利用高浓度的盐或糖保存食品，如腌渍蔬菜、肉类及果脯蜜饯等，糖的浓度通常在507

49、0%，盐的浓度为515%，由于盐的分子量小，并能电离，在二者百分浓度相等的情况下，盐的保存效果优于糖。 有些微生物耐高渗透压的能力较强，如发酵工业中鲁氏酵母，另外嗜盐微生物（如生活在含盐量高的海水、死海中）可在1530%的盐溶液中生长,嗜盐微生物有的微生物必须在3-5%的氯化钠溶液中才能良好地生长，这类微生物叫嗜盐微生物。 耐盐微生物能在2%左右氯化钠溶液中生长良好的微生物叫耐盐微生物。 渗透压与食品加工的关系：A 利用氯化钠提高渗透压保藏食品：B 利用糖提高渗透压保藏食品： 四 、辐射：电磁辐射包括可见光、红外线、紫外线、X射线和射线等均具有杀菌作用。在辐射能中无线电波最长，对生物效应最弱；

50、红外辐射波长在8001000纳米，可被光合细菌作为能源；可见光部分的波长为380760纳米，是蓝细菌等藻类进行光合作用的主要能源；紫外辐射的波长为136400纳米，有杀菌作用。 （1）紫外线杀菌机理：紫外线波长以265266纳米的杀菌力最强，其杀菌机理是复杂的，细胞原生质中的核酸及其碱基对紫外线吸收能力强，当这些辐射能作用于核酸时，便能引起核酸的变化，破坏分子结构，主要是对DNA的作用，最明显的是形成胸腺嘧啶二聚体，妨碍蛋白质和酶的合成，引起细胞死亡。多倍体和二倍体细胞抗紫外线的能力比单倍体强，芽孢和孢子比营养细胞抗紫外线的能力强,紫外线的杀菌效果，因菌种及生理状态而异，照射时间、距离和剂量的

51、大小也有影响，由于紫外线的穿透能力差，不易透过不透明的物质，即使一薄层玻璃也会被滤掉大部分，在食品工业中适于厂房内空气及物体表面消毒，也有用于饮用水消毒的。 （2）紫外线的诱变作用：适量的紫外线照射，可引起微生物的核酸物质DNA结构发生变化，培育新性状的菌种。因此，紫外线常常作为诱变剂用于育种工作中。 波长在100 400nm的电磁辐射为紫外线。其中波长在260 280nm的紫外线杀菌力最强的原因是：核酸（DNA、RNA）的吸收峰为260nm，蛋白质的吸收峰为280nm。 （3）超声波 超声波（频率在20000赫兹以上）具有强烈的生物学作用。超声波使微生物致死的机理是引起微生物细胞破裂，内含物

52、溢出而死。超声波作用的效果与频率、处理时间、微生物种类、细胞大小、形状及数量等有关系，一般频率高比频率低杀菌效果好，病毒和细菌芽孢具有较强的抗性，特别是芽孢,测验,一 名称解释：连续发酵 同步生长 D值 商业灭菌 二 判断正误 1. 紫外线杀菌力最强的波长是500nm ，杀菌的机理是微生物的蛋白吸收了紫外线。（） 2.微生物在高渗透压的（2%的盐）环境中才能生长良好。（） 3.棉塞的作用有三个，分别是外边的微生物不能进入试管，试管内的微生物不能污染环境，空气可以进入试管。（） 4.MPN是指大肠菌群测定时根据实验结果查表的最近似数。（） 5.鉴定真菌最常用的方法是形态学观察。（） 6.平板培养

53、微生物时，培养皿倒置的目的是防止污染和防止水分过快的蒸发。（） 7. 在酵母菌的形态观察中活细胞是无色，兰色是四细胞。（,2 化学因素对微生物生长的影响,一、pH 微生物生长的pH值范围极广，一般在pH28之间，有少数种类还可超出这一范围，事实上，绝大多数种类都生长在pH5 9之间。 不同的微生物都有其最适生长pH值和一定的pH范围，即最高、最适与最低三个数值，在最适pH范围内微生物生长繁殖速度快，在最低或最高pH值的环境中，微生物虽然能生存和生长，但生长非常缓慢而且容易死亡。一般霉菌能适应pH值范围最大，酵母菌适应的范围次之，细菌最小。霉菌和酵母菌生长最适pH值都在56，而细菌的生长最适pH

54、值在7左右,表417 一般微生物生长的pH范围,PH通过影响细胞质膜的通透性、膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来影响营养物质的吸收，从而影响微生物的生长速率。尽管特定的微生物生长需要一定的pH，最适生长pH只代表了外环境的pH，而内环境pH必须接近中性，以防止那些对酸碱易变性的大分子受到破坏。在极端的嗜酸或嗜碱菌中，它们内部的pH可以从中性改变11.5，但是大多数微生物用于生长的最适pH68之间（指中性微生物），其细胞质膜保持中性或极接近中性。 PH不仅影响微生物的生长，还影响到微生物代谢产物的能力，同一种微生物在不同的pH条件下，常常代谢产物的种类发生变化，因此生产中要注意检测和调节发酵

55、液中pH的变化。 (1)不同的微生物有不同最适生长PH ； （2）通常最适生长PH不一定是最适发酵PH ； （3）同种微生物不同发酵PH条件下发酵产物可能不同；如柠檬酸的发酵，在PH值为2-3时发酵产物是主要是柠檬酸； PH值接近中性时，发酵产物主要为草酸，少数的柠檬酸。酵母菌PH值为4.5-5时进行乙醇发酵， PH值高于8时，发酵产物除乙醇外，还有甘油、醋酸,1、同一种微生物由于发酵液pH值不同，积累的的代谢产物不同。如黑曲霉： pH值为23时，发酵产物主要是柠檬酸为主，少量的草酸。 pH值为7左右时，发酵产物主要以草酸为主，少量的柠檬酸。 2、同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程

56、中，对环境pH值要求不同。 如：丙酮丁醇梭菌 pH值=5.57.0时，是以菌体生长为主； pH值=4.35.3时，进行丙酮丁醇的发酵,1 高浓度的H离子对微生物的影响：使菌体表面蛋白质和核酸水解，菌体发生形态和性质上的改变，也影响酶的活性。 调节pH值的方法：（1）在培养基中加入磷酸盐类或加入碳酸盐； （2）采用加入碳源或氮源方法调节酸碱变化； （3）直接用酸碱调节pH值变化； 食品工业中利用酸抑制微生物的生长，将酸作为防腐剂添加在食品中，同时增进食品的风味，要求对食品质量无影响、对人体安全五毒，常用有机酸及其盐类。 A、苯甲酸及钠盐： 使用条件：pH值4.5使用， pH值5.5无效，使用浓度

57、：为0.2-1g/ kg，GB2760-96国家标准。抑制菌的范围：对许多微生物有效，但对产酸菌、芽孢作用弱，对酵母菌的抑制作用大于霉菌。使用范围：果酱果汁、酱油醋、低盐酱菜、蜜饯等。 B、山梨酸及其钾钠盐：使用条件：pH值4.5使用，使用浓度：为0.075-1g/ kg，GB2760-96国家标准。抑制菌的范围：对许多微生物有效，但对产酸菌、芽孢作用弱，对霉菌的抑制作用大于酵母菌。使用范围：果酱果汁、酱油醋、低盐酱菜、蜜饯等。 C、柠檬酸、乳酸： D、丙酸及其钙、钠盐：抑制菌的范围：在酸性的环境中能有效地抑制和延迟霉菌的生长，对酵母菌的效果差,适用范围：面包、糕点、奶酪等，0.1%的浓度添加

58、在面包蛋糕中，可在15-30天不长霉，最高不能超过0.32%。 E、脱氢醋酸及钠盐：抑制范围：脱氢醋酸及其钠盐是一种毒性小、广谱的防腐剂，对霉菌、酵母、细菌的抑制作用较苯甲酸好，其抑菌效果随pH值的下降而升高， pH值为6时也有效，应用不受热和pH值的影响，相对稳定性高，特别适用于焙烤食品，但对梭状芽孢杆菌属及乳酸菌效果差。与丙酸钙复合使用更好。 适用范围：浓缩橙汁、清凉饮料、炼乳、面包、豆腐乳、榨菜等。使用浓度在0.05%-0.1%。研究中它对酵母的活力有影响，因此对面团的醒发时间有延长。 F、DMF： 富马酸二甲酯（C6H8O4），是一种安全、高效、低毒的广谱防腐剂， 应用的pH值范围广，

59、对细菌、霉菌及酵母菌等均有较强的抑制作用，尤其对霉菌的抑制作用好。适用范围：主要在月饼中使用。 使用方法：600-800mg/ kg 可完全抑制细菌、酵母菌； 100mg/ kg 可抑制霉菌； 0.1% DMF于面包中，475天不长霉菌； 0.1% 丙酸钙于面包中，15-30天不长霉菌一般加在食品的外包装中，防止“死角”出现，以免造成适合霉菌生长的“小气候,G 乳链球菌素：天然、高效、卫生安全的防腐剂，在酸性的条件下溶解好，34氨基酸的多肽，分子量为3510Da，活性成分是二聚体、四聚体，含5个不同于其它蛋白质的二硫链。 H 纳他霉素,抑制范围：对G+细菌有效、对G-、酵母菌、霉菌无作用。 使

60、用方法：按GB2769-96标准，0.2-0.5g/ kg应用在罐头、乳品及发酵泡菜等食品中。 2 高浓度的OH-离子对微生物的影响： 强碱能水解蛋白质和核酸，使微生物细胞的酶系和细胞结构受到破坏，同时还可以分解菌体中的糖类，引起细胞死亡。 OH-离子的浓度越高杀菌力越强。 杀菌效果：病毒和G-菌比G+菌对碱敏感，芽孢杆菌、分枝杆菌对碱具有强大的抵抗力。 使用范围：食品工业中常用碱类作为环境、加工设备、包装设备容器进行消毒。 Figure Approximate pH growth ranges for some foodborne organisms,pH0 1 2 3 4 5 6 7 8