《分子生物学技术》PPT课件.ppt

1、常用分子生物学技术的原理和应用,的变性,在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使双螺旋结构松散，变成单链，即为变性。 DNA是否发生变性的常用指标是DNA对260 nm波长吸光值（A260）变化。 实验室最常用的方法是加热,的复性,变性在适当条件下，两条互补链可重新配对，恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。 热变性的经缓慢冷却后即可复性，又称退火,核酸分子杂交,DNA复性时，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在一定程度配对关系，在适宜的条件下（T、离子强度），就可以在不同的分子间形成杂化双链。 杂化双链可以在不同的DNA分子

2、之间、DNA与RNA之间、 RNA与RNA之间。 核酸研究中的应用十分广泛,探针技术,探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检测核酸样品中的基因。 标记物：同位素、生物素或荧光染料 核酸片段：人工合成、克隆的基因组DNA、cDNA、RNA 探针种类：DNA、RNA,印迹技术(Blotting): 将在凝胶中分离的生物大分子转移(印迹)在固相化介质上并加以检测分析的技术。 (1) DNA 印迹: Southern blotting (2) RNA 印迹: Northern blotting (3) 蛋白质印迹: Western blotting,印

3、迹技术基本原理 凝胶电泳 转移 杂交 放射自显影 或化学显色,Southern blotting（DNA印迹技术） 组织或细胞中基因组DNA经限制性内切酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA区带的凝胶放入变性溶液变性后，使胶中的DNA分子转移到NC膜上。转移完成后，加热使DNA固定于NC膜上，用于杂交反应可进行DNA印渍。 主要用于：基因组DNA定性和定量分析；亦可用于分析重组质粒,RNA 印迹技术: Northern blotting,与DNA blotting（ Southern blotting）原理相同 检测RNA 无需限制性内切酶切割 用途： 已知的特异mRNA表达水平； 比较不同

4、组织或细胞的同一基因表达情况,蛋白质印迹（Western Blotting,1.蛋白质样品 2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 3.电转移蛋白质至NC膜 4. 特异抗体做探针（一 抗），碱性磷酸酶、辣 根过氧化物酶标记或同 位素标记第二抗体。 5.检测样品中特异性蛋白 质的存在，细胞中特异蛋 白质的半定量分析,PCR技术（Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应 ：将微量的特异的DNA片段在体外快速扩增的技术。 原理:以目的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。不

5、断重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增,PCR 反应体系的基本成分,模板DNA，特异引物，DNA聚合酶（具耐热性）、dNTP以及含有Mg2的缓冲液,DNA Semiconservative Replication,PCR基本反应步骤,变性：95模板DNA变性成为单链 退火：54引物与模板DNA结合 延伸：72DNA聚合酶催化DNA合成 三个步骤为一个循环。新合成的DNA分子作为下一轮合成的模板，经多次循环（2530次）后即可达到扩增DNA片段的目的,PCR的主要用途,目的基因的克隆 为重组DNA获得目的基因提供了简便快速的方法 基因的体外突变 利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因

6、的嵌合、缺失、点突变等改造。 DNA和RNA的微量分析 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要。 DNA序列分析 基因突变分析,PCR衍生技术,反转录PCR技术 mRNA反转录生成cDNA, cDNA 为模板PCR扩增 原位PCR技术 在组织切片或细胞涂片单个细胞内PCR反应，再进行原位杂交 实时PCR技术 引入一对特殊的荧光标记引物探针，5端有一个荧光报告分子，3端有一个荧光淬灭分子；PCR进行时Taq酶遇到荧光探针可以酶切，根据荧光信号进行定量,核酸序列分析,1965年 Robert Holly用了7年完成了酵母丙氨酸-tRNA的76个核苷酸的序列测定 DNA序列分析仪24小时内可完成约10000个碱基序列的测定工作,DNA链末端合成终止法（Sanger法,四种2,3-双脱氧核苷酸（ddNTP）代替部分脱氧核苷酸（dNTP）作为底物进行DNA合成反应。 依据是ddNTP核糖的第三位位碳原子上不含羟基，不能与下一核苷酸反应形成磷酸二酯键，致使DNA合成反应终止。 模板分四组，反