生物化学：4.Chapter4 核酸的化学

1、第四章 核酸化学,1.核酸的组成成分 2.RNA的结构 3.DNA的结构 4.核酸及核苷酸的性质 5.核酸及其组分的分离纯化 6.核酸的分析测定及研究方法,什么是核酸？,1869年核酸最早分离自外科绷带脓细胞的细胞核，当时发现这种物质含磷量之高超过当时发现的任何一种有机物，并且含有很强的酸性，故得名核酸。 1909年其组成被研究清楚，1944年生物功能初步澄清，在X射线衍射技术支持下1951年结构澄清。 核酸是脱氧核糖核酸（DNA）与核糖核酸（RNA）的通称。,第一节 核酸的组成成分,核酸,核苷酸,水 解,一、戊糖,核糖 (in RNA),2脱氧核糖 (in DNA),嘧啶,1,2,3,4,5

2、,6,H,胞嘧啶 Cytosine,（C）,尿嘧啶 uracil,（U）,H,H,胸腺嘧啶 thymine,（T）,（一）嘧啶碱,二、碱基,（二）嘌呤碱,1,2,3,4,5,6,7,8,9,嘌呤,腺嘌呤 adenine,（A）,鸟嘌呤 guanine,（G）,RNA,DNA,尿嘧啶 U,胸腺嘧啶 T,胞嘧啶 C,鸟嘌呤 G,腺嘌呤 A,稀有碱基,嘌呤次黄嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、N2、N2-二甲基鸟嘌呤。 嘧啶5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、二氢尿嘧啶、4-巯尿嘧啶 都是基本碱基的化学修饰型。,鸟嘌呤,次黄嘌呤,1-甲基次黄嘌呤,H,H,烯醇式,三、核苷（nucleoside）,核苷 戊糖+碱

3、基 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键,Adenosine Guanosine Cytidine Uridine,四、核苷酸,磷酸,碱基,戊糖,核苷酸,碱基连接（核苷键）,脂 键,（对DNA为H）,1,2,3,4,5,八种核苷酸如下表所示,M 单(D 二、T三） ；P 磷酸 RNA的名称为某（单、二、三）苷酸，DNA在某（单、二、三）前加脱氧两字。如AMP称腺苷磷酸(或腺苷酸），dAMP称为脱氧腺苷磷酸（脱氧腺苷酸）。 稀有核苷酸与上类似；,P,-O,胸苷-5-磷酸,O,各种核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸是体内合成RNA和DNA合成的直接原料。,在体内能量代谢中的作用：,ATP能量“货币”,

4、UTP参加糖的互相转化与合成,CTP参加磷脂的合成,GTP参加蛋白质和嘌呤的合成,环化磷酸化：,cAMP,cGMP,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。,五、修饰成分,尿苷,OH,假尿苷（）,第二节 RNA的结构,一、RNA的类别及分布 二、RNA一级结构的概念 三、核酸的降解 四、RNA一级结构的测定 五、RNA一级结构的特点 六、RNA的高级结构,（一）细胞质RNA,核糖体核糖核酸（rRNA）； 转运核糖核酸（tRNA）； 信使核糖核酸（mRNA）。,1、rRNA (核糖体RNA),约占全部RNA的80%， 是核糖核蛋白体的主要组成部分。 r

5、RNA的功能与蛋白质生物合成相关。,Ribosome RNA,2、tRNA (转移RNA),约占总RNA的10-15%。 它在蛋白质生物合成中起翻译氨基酸信息，并将相应的氨基酸转运到核糖核蛋白体的作用（通过其反密码子与mRNA的密码子的互补识别）。 已知每一个氨基酸至少有一个相应的tRNA。 RNA分子的大小很相似，链长一般在73-78个核苷酸之间。,Transfer RNA,3、mRNA (信使RNA),约占总RNA的5%。 不同细胞的mRNA的链长和分子量差异很大。 它的功能是将DNA的遗传信息传递到蛋白质合成基地 核糖核蛋白体，是蛋白质生物合成的摸板。,Messenger RNA,（二）

6、细胞核RNA（三）线粒体RNA和叶绿体RNA（四）病毒RNA,二、RNA一级结构的概念,组成RNA的核苷酸按特定序列通过 3,5-磷酸二酯键连接的线性结构。,A,核苷酸,首端,末端,3,5,1,P,P,P,OH,A,T,G,pGpTpAOH,pG-T-A,pGTA,同样适用于DNA：,三、核酸的降解,（一）化学降解 1、碱降解 2、酸降解 （二）酶法降解 1、核糖核酸酶类 2、核酸外切酶 3、磷酸单酯酶 4、脱氧核糖核酸酶类,五、RNA一级结构的特点,对于RNA的一级结构，研究最多的是tRNA。tRNA的5，-末端总是磷酸化，而且常是pG ；3，-末端最后三个氨基酸顺序相同，总是CCAOH ；

7、tRNA中含有较多的稀有碱基，每分子含715个，稀有碱基中最常见的是甲基化的碱基。,在rRNA分子中，研究最多的是5SrRNA和16SrRNA。大肠杆菌中的5SrRNA的5，-端常出现pppU，3，-端为UOH ；第4347位的核苷酸顺序为CGAAC（真核细胞此序列则出现在5.8SrRNA），这是rRNA与tRNA相互识别、相互作用的部位；原核细胞16SrRNA的3，-端总存在序列ACCUCCU，这是mRNA的识别位点。,mRNA相对分子质量不均一，代谢活跃，这给一级结构的研究带来一定困难。真核细胞mRNA与原核mRNA比较，在结构上具有明显的区别。真核细胞mRNA的3，-末端有一段可长达20

8、0个左右的聚腺苷酸（poly A），称为“尾”结构；5，-末端有一个甲基化的鸟苷酸,称为“帽”结构，表示m7Gp5p5pXpmY，其中X、Y为任意碱基。这种“尾”和“帽”的结构在mRNA功能表现中具有重要作用。,回文序列中的单链可形成发卡结构,RNA中的碱基配对原则； A-U G-C,六、RNA的高级结构,（一）tRNA的三叶草型二级结构,1,2,3,叶子,反密码子环,反密码子,载运氨基酸,臂,稀有碱基,（二）tRNA的三级结构： 倒L形,所有的tRNA折叠后形成大小相似及三维构象相似的三级结构，这有利于携带的氨基酸的tRNA进入核糖体的特定部位。,3氨基酸臂,反密码子环,第三节 DNA的结构

9、,DNA分子含有生物物种的所有遗传信息，分子量一般都很大。 （除RNA病毒外） DNA为双链分子，其中大多数是链状结构大分子，也有少部分呈环状结构。,一、DNA的一级结构,概念：构成DNA的脱氧核苷酸按照一定的排列顺序，通过3,5-磷酸二酯键相连形成的线形结构。,(一) DNA一级结构的概念,脱H2O 脂键相连,3，5-磷酸二酯键,首,尾,基因是DNA片段的核苷酸序列，DNA分子中最小的功能单位。,基因,结构基因,调节基因,基因组,（二）DNA的一级结构的测定,1.Sanger双脱氧链终止法（酶法测序）,DNA的合成总是从5端向3端进行的。DNA的合成需要模板以及相应的引物链。DNA的合成过程

10、中，在合成的DNA链的3末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的3,5磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的DNA链。具体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列,如下图所示：,模板,引物,GGC,GGCC,GGCCATC,C,ddCTP,GGCCA,GGCCATCGTTGA,ddATP,A,GG

11、CCATCG,GGCCATCGTTG,G,ddGTP,GGCCAT,GGCCATCGT,GGCCATCGTT,T,ddTTP,2. MaxamGilbert DNA 化学降解法,(1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P； (2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰； (3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链； (4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开； (5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列,如下图所示：,基本步骤：,化学裂解法测定DNA的核苷酸序列,（三）真核细胞染色质DNA的一级结构特点,1. 重复序列,单拷贝序列,：在整个DNA中只

12、出现一次或少数几次，主要为编码蛋白质的结构基因。,中度重复序列,：在DNA中可重复几十次到几千次。,高度重复序列,：可重复几百万次,2. 间隔顺序与插入顺序,mRNA,1 872bp,内含子（intron)：基因中不为多肽编码，不在mRNA中出现。,外显子（exons）：为多肽编码的基因片段。,例外：组蛋白基因(histongene)和干扰素基因(interferon gene)没有内含子。,3、 回文结构,所谓回文序列就是指DNA某一片段旋转180。后,顺序不变的序列，回文序列中的单链可形成发夹结构。双链可形成十字架结构。这种发夹结构或十字架结构在大肠杆菌细胞DNA中已有发现.,核酸分子中的

13、回文序列,回文序列中的单链可形成发卡结构,双链回文序列可形成十字架结构,（一）DNA的碱基组成（Chargaff法则）,本世纪20年代，Levene研究了核酸的化学结构并提出四核苷酸假说；50年代初，Chargaff应用紫外分光光度法结合纸层析等简单技术，对多种生物DNA作碱基定量分析，发现DNA碱基组成有如下规律：,二、DNA的二级结构,不同生物来源的DNA四种碱基比例关系,1. 同一生物的不同组织的DNA碱基组成相同； 2. 同一种生物DNA碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或者环境变化而改变；,DNA碱基组成规律：,3. 几乎所有的DNA，无论种属来源如何，其腺嘌呤摩尔含量与胸腺嘧啶摩尔

14、含量相同A =T，鸟嘌呤摩尔含量与胞嘧啶摩尔含量相同G =C，总的嘌呤摩尔含量与总的嘧啶摩尔含量相同AG=CT。 4. 不同生物来源的DNA碱基组成不同，表现在AT/GC比值的不同。这些结果后来为DNA的双螺旋结构模型提供了一个有力的佐证。,A.DNA碱基互补原则,(二)、 DNA二级结构的多态性,其他组合易相互排斥 例 如 G:T,因 此 ， DNA 的 双 股 系 藉 著 A:T 和 G : C的 配 对 关 系 互 相 结 合 。,DNA 一 股 的 核 苷 酸 序 列 与 另 一 股 的 序 列 互 补（A-T、G-C）。,B.二级结构B型双螺旋结构,大 部 分 DNA 所 具 有 的

15、 双 螺 旋 结 构 ， 亦 称 为 B 型,1.反向、平行、右手螺旋,2.链间碱基配对相连 3.每10个碱基对螺旋上升一周 4.一条链为主动链，另一条为被动链；,C.双螺旋结构的稳定因素,DNA双螺旋在生理状态下十分稳定，结构不发生变化。 提问：起稳定作用的有哪些力呢？,答案：疏水作用力（主要） （又称碱基堆积力） 氢键 范德华力,在 真 核 及 原 核 细 胞 皆 有 证 据 显 示 短 的 Z 型 DNA 存 在 。,D.其他类型的DNA双螺旋,Z 型 DNA左旋、细长,E.三链DNA,F.四链DNA,1、超螺旋结构,三、,2、真核细胞染色质的组装,第三节 核酸及核苷酸的性质,1、性状：

16、RNA及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色的粉末或结晶；DNA则为疏松的石棉一样的纤维状固体。,2. 溶解性 提问：？ 答案：微溶于水，不溶于一般的有机溶剂,DNA和RNA在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白。DNA核蛋白与RNA核蛋白的溶解度受溶液的盐浓度的影响而不同。DNA蛋白在低浓度的盐溶液中随盐浓度的增加而增加，在1mol/L的NaC溶液中溶解度比纯水高2倍，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，仅为水的1%，几乎不溶解；而RNA蛋白在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L的NaCl溶解度较大。因此在核酸的提取中，常用此法将两种核蛋白分开，然后用

17、蛋白质变性剂去除蛋白质。,3. 酸碱性 提问：？ 答案：两性，偏酸,核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNA的pI约为45，RNA的pI约为2.02.5，在pH78电泳时泳向正极。,核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解离，因此核酸是两性电解质。 碱基的解离：嘧啶和嘌呤环上的N及各取代基具有结合和释放质子的能力。 核苷的解离：碱基和核糖具有结合和释放质子的能力。 核苷酸的解离：磷酸基具有较强的酸性，核酸的两性解离主要决定于磷酸基和含氮碱基,4.紫外吸光性 提问：为什么核酸有紫外吸光性？ 答案：碱基含有共轭大键，最大

18、吸收波长260nm(蛋白质280nm)；,核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少3040%，当核酸变性或降解时光吸收值显著增加（增色效应），但核酸复性后，光吸收值又回复到原有水平（减色效应）。,5 变性与复性,提问：什么是核酸的变性？ 答案：核酸分子高级结构的破坏，从而引起核酸理化性质及生物学功能发生改变 变性因素：高温（一般75）、强氧化剂、强酸、碱、尿素等；,DNA变性是个突变过程，类似结晶的熔解。将紫外吸收的增加量达到最大增量一半时的温度称融熔温度(melting temperature, Tm)。,Tm,Tm,（1）G-C的相对含量 （G+C）% =（Tm 69.3） 2.44,（2）

19、介质离子强度低，Tm低。,（3）高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力。,（4）变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。,影响Tm的因素：,提问：什么是核酸的复性？ 答案：一定条件下，去除变性因素后，核酸恢复二级结构及生物活性的现象；通常使用热复性。,热复性在基因测序中被广泛应用,（1）单链片段浓度,（2）单链片段的大小,（3）片段内重复序列的多少,（4）溶液离子强度的大小,（5）溶液温度的高低 （T 25）,影响复性速度的因素：,第五节 核酸及其组分的分离纯化,一、分离核酸的一般原则,因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究

20、的基础。,防止核酸酶的降解 防止化学因素的降解 防止物理因素的降解,二、DNA的分离纯化(DNP中蛋白质的去除),1.用苯酚提取:水饱和的新蒸馏苯酚与DNP振荡，冷冻离心DNA在上层水相 2.三氯甲烷-戊醇(3:1):振荡，离心，取水相，反复 3.去污剂法:如SDS 4.CsCl密度梯度离心 5.柱层析:羟甲基磷灰石，甲基白蛋白硅藻土 可用柠檬酸钠(枸橼酸钠)去除Mg2+以抑制DNase,三、RNA的分离纯化,1.10%NaCl中加热至90，离心，上清中用乙醇沉淀或用等电点沉淀 2.盐酸胍(终浓度2mol/L):RNA粗沉淀用氯仿去除少量残余蛋白质 3.去污剂法:SDS 4.苯酚法(90%)

21、5.柱层析:如寡聚dT-纤维素柱分离mRNA 可用皂土抑制RNase,四、核酸组分的分离纯化,1、离子交换法分离核酸组分 2、凝胶过虑法分离核苷酸组分,第六节 核酸的分析测定及研究方法,一、核酸及其组分含量的测定 二、核酸纯度的测定 三、核酸的凝胶电泳 四、核酸分子杂交 五、印迹技术 六、PCR技术,一、核酸及其组分含量的测定,1、紫外吸收法,在一定pH下测定样品的紫外吸光度（A260），即可由下式计算样品中的核酸含量：,C=MrA260/L,C ：核酸的含量（mg/mL）；Mr ：相对分子质量；A260 ：核酸溶液的吸光度； ：摩尔消光系数（即1升溶液中含1摩尔核酸的光吸收值）；L ：比色杯的内径（cm）,2、定糖法,核糖 + H +,糠醛,甲基间苯二酚,FeCl3,绿色产物,脱氧核糖 + H+,-羟基-酮戊醛,二苯胺,蓝色产物,RNA的测定：,DNA的测定：,670-680nm波长下进行比色测定,595-620nm波长下进行比色测定,3、定磷法,RNA和DNA中都含有磷酸，可以进行磷的测定。纯的核酸中含磷量在9.5%左右，因此，测出核酸中的磷含量就可计算核酸的含量。 用强酸消化核酸成无机磷酸，后者与定磷