基因诊断与基因治疗.ppt

1、第 二 十 一 章,基因诊断与基因治疗 Genetic Diagnosis and Gene Therapy,基因变异致病类型,内源基因的变异 由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影响，人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发生异常，从而导致疾病,外源基因的入侵 如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并在体内增殖而引起各种疾病,第一节 基因诊断Gene Diagnosis,一、基因诊断的概念、内容和特点,定义: 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 前提条件： 已明确疾病表型与基因型的关系,基因诊断的基本内容,

2、检测个体基因序列特征 基因突变分析 测定基因拷贝数 基因表达产物分析 测定是否存在外源基因,特点: 1.以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊 断”，针对性强。 2.分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，故具有很高的特异性。 3.由于分子杂交和聚合酶链反应（PCR）技术都具有放大效应，故诊断灵敏度很高。 4.适用性强，诊断范围广。 5.检测外源基因时，可以检测出潜伏的病原体,基因变异致病类型,内源基因的变异 由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影响，人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发生异常，从而导致疾病,外源基因的入侵 如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并在体内增殖而

3、引起各种疾病,二、基因诊断常用技术方法,限制性内切酶谱分析法 DNA限制性长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RLFP)分析 等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide, ASO,一）核酸分子杂交技术,Mst酶切位点(GCTNAGG,5,3,正常基因,突变基因,1.15kb,1.35kb,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带着,患者,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异，中性

4、变异导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该DNA片段就会产生长度不的片段，称为限制性片段长度多态性。在某一特定家族中，如果某一致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可利用这一多态性片段作为一种“遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者,DNA限制性片段长度多态性（RFLP,RLFP分析法,二）聚合酶链反应 (PCR,PCR/单链构象多态性分析 (single strand conformation polymorphism, SSCP) PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析

5、确定致病基因的存在,正常人,纯合突变,杂合突变,Leber 病患者 PCR/SSCP分析,PCR/等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide， ASO,三）基因测序 即测定DNA序列的技术。分离患者的有关基因，测定出碱基排列顺序，找出其变异所在，是最确切的基因检测方法。 目前用于测序的技术主要有Sanger等发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert发明的化学降解法,四）基因芯片,基因芯片(gene chip)（又称DNA芯片、生物芯片）通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探

6、针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。 应用领域:基因表达谱分析、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等,三、基因诊断的应用,遗传性疾病 肿瘤 感染性疾病，传染性流行病 判断个体疾病易感性 器官移植组织配型 法医学中个体识别、亲子鉴定,第二节 基因治疗Gene Therapy,定义 早期是指将外源正常基因导入靶细胞，整合入细胞基因组，纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病以达到治疗的目的一种治疗方法,目前广义上来讲是指将某种遗传物

7、质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。通过基因水平的操作而治疗疾病的方法,一、基因治疗的概念,1、基因修正（gene correction） 2、基因替代（置换） （gene replacement） 3、基因增强（补偿） （gene augmentation） 4、基因抑制（gene constraint）和/或 基因失活（gene inactivation） 5、免疫基因治疗 6、活化前体药物基因（自杀基因）治疗 7、耐药基因治疗,二、基因治疗的策略,三、基因治疗的种类,1、生殖细胞（germ cell）基因治疗,理论上将正常细胞基因转移到患者的生殖细胞 （精细

8、胞，卵细胞早期胚胎）使其发育成正常个体。这是理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中播散,2、体细胞（somatic cell）基因治疗,是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代,四、基因治疗方式 一、体内疗法（in vivo、一步法） 将携带有治疗基因的载体直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的组织并进行表达。 二、体外疗法（ex vivo、二步法） 先把待接收基因的靶细胞从体内取出，将携带有治疗作用的载体导入培养细胞内，筛选、增殖，再回输体内有关组织中,目的基因+载体 重组DNA 受体细胞 外源基因表达的筛选 回输体内,

9、五、基因治疗的基本程序,1、为致病基因 2、遗传分子机制清楚 3、该基因已被克隆，一级结构和表达调控机 制清楚 4、可在体外操作，而且安全有效 5、转移基因能完整地、稳定地整合，并能适时适量表达,一）目的基因的选择原则,1、基因组DNA文库 2、cDNA（complementary DNA） 3、人工合成基因片段 4、PCR扩增,目的基因的来源,二）受体细胞的选择原则,1、最好选择组织特异性细胞 2、容易取出 3、具有较长的寿命 4、离体细胞能高效导入目的基因 5、经体外操作后能存活并安全回输 常用的的受体细胞： 淋巴细胞、造血干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、骨骼肌细胞、血管内皮细胞、呼吸道上

10、皮细胞、肿瘤细胞,三）载体的选择和外源基因的导入,病毒载体 RNA病毒载体（逆转录病毒） DNA病毒：常用的有腺病毒、疱疹病毒、 SV40病毒、巨细胞病毒、 腺相关病毒、单纯疱疹病毒等 非病毒载体 质粒、脂质体、受体介导的蛋白,目前应用最多的最成功的是逆转录病毒，病毒感染细胞后，其基因组RNA 经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。 完整的病毒颗粒具有插入宿主染色体必需的全套酶系统，适用于介导基因转移,逆转录病毒（retrovirus,1、主要来自莫洛尼氏小鼠白血病病毒（Molo

11、ney murine leukemia virus，MoMLV）其中三个结构基因（gag、pol、env）被删除 2、标记基因（marker gene）插入空缺，供阳性选择用。如：新霉素抗性基因（neomycin resistant gene），该基因编码新霉素磷酸转移酶（NPT），能对抗新霉素（G418）。 3、有目的基因的插入位点,逆转录病毒载体的构建,逆转录病毒载体的优点,1.可插入足够长的外源DNA（7KB） 2.基因转移效率高，几达100% 3.重组体可整合入宿主染色体，并稳定表达和传代 4.宿主范围广、比较安全,缺点,1.只能整合入分裂活跃的细胞 2.靶细胞表面需要有特殊的受体 3

12、.必须使用带有“辅助病毒”的包装细胞系 4.病毒滴度低,包装细胞：一种细胞，重组逆转录病毒载体只能在其中包装成没有感染能力的病毒颗粒，但能从中释放出去，这种细胞即包装细胞。 1.多数由各种辅助病毒转染小鼠成纤维细胞系 NTH3T3构成。 2.辅助病毒由MoMLV切除了病毒5端LTR至Gag起始密码之间包装信号等序列，虽能产生病毒蛋白但不能进行包装。 3.导入的逆转录病毒载体转录出的RNA可以利用辅助病毒产生的病毒蛋白包装成假病毒颗粒,包装细胞系,四）外源基因表达的筛选 在较多的表达载体中都有neor标记基因存在，若向培养基中加入药物G418，未被转化的细胞不存在neor标记基因，细胞不能存活，

13、最后只有转化细胞存活下来,五） 回输体内,1.选择合适的疾病：单基因遗传病 2.具备该病分子缺陷的知识 3.有目的基因的克隆 4.克隆基因的有效表达 5.克隆基因的有效调节 6.可利用的动物模型,遗传病基因治疗的必要条件,四、基因治疗的应用,一）遗传病的基因治疗,基因治疗的部分对象,1.严重联合免疫缺陷症（腺苷脱氨酶ADA缺乏） 2.囊性纤维变性 3.Gaucher病型（葡糖脑苷脂酶缺陷） 4.苯丙酮酸尿症（苯丙氨酸羟化酶缺陷） 5.血友病B（凝血因子缺陷） 6.家族性高胆固醇血症 7.地中海贫血,1.宿主的修饰：保护分裂旺盛的正常组织，如造血干细胞：导入二氢叶酸还原酶基因，获得对氨甲蝶呤的抗性 2.增强肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）活性： 如将肿瘤坏死因子（TNF）基因导入TIL。这是目前肿瘤基因治疗最常用的方法。 3.肿瘤细胞的修饰,二）肿瘤的基因治疗,如： 自杀基因 + 病毒载体 转染 重组载体,药物前体 (无毒) Gene酶 药物复合物(有毒,细胞死亡,例如： 单纯疱疹病毒 哺乳动物细胞 HSV Gene-TK （在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达） GeneTK GCV（胸苷类似物） TdR P p GCV-p 抑制DNA合成 脱氧胸苷酸 肿瘤细胞死亡 邻近细胞死亡/凋亡（旁观者效应,三）艾滋病的基因治疗 （四）心血管疾病、