分子克隆技术实验讲义2016.3(最终版)

1、.分子克隆技术实验讲义黑龙江大学生命科学学院2016年3月甜菜m14品系bvm14-glyi基因的克隆与鉴定一、实验目的 1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。 2、学习和掌握质粒、t载体的特点。 3、学习和掌握ta克隆的连接体系及操作要点。 4、学习和掌握xcm酶切制备t载体的过程及方法。 5、学习和掌握cacl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。 6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。 7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。 8、学习并掌握碱法小量制备质粒dna的原理及操作步骤。精品.二、相关知识（一）t载体的制备pmd18-t vector是一种

2、高效克隆pcr产物（t-a cloning）的商业化专用载体，由pc 18载体改建而成。在pc 18多克隆位点处的xba和sal识别位点之间插入了ecor识别位点，用ecor进行酶切反应后，再左两侧的3端添加“t”而成，可以大大提高pcr产物的连接、克隆效率。相关知识点：（1）质粒的提取；（2）酶切；（3）pcr等。（二）dna的重组与连接（pcr产物的克隆）把dna片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。所谓重组，就是把外源目的基因“装进”载体的过程，即dna的重新组合。为了将目的基因重组于载体分子中，需要将载体dna和目的基因分别进

3、行适当处理，一般采用内切酶法将载体dna分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配伍末端（compatible end），以产生末端连接。现在一些生物公司也开发了针对不同插入dna片段的专用载体，如专门用于克隆pcr产物的载体，大大方便了实验操作。相关知识点：（1）克隆与亚克隆；（2）dna重组；（3）内切酶；（4）粘性末端与平末端；（5）连接酶；（6）连接酶的分类及功能等。（三）大肠杆菌感受态细胞的制备外源基因与载体在体外连接成重组体dna分子后，需将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖，或称为克隆。受体

4、细胞也叫宿主细胞，大肠杆菌宿主菌是目前基因工程最常用的受体细胞。感受态细胞（competent cell）是经过一定方法处理后，具有接受外源dna能力的大肠杆菌，只有发展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的dna分子。相关知识点：（1）克隆；（2）宿主细胞的定义及分类；（3）感受态细胞定义及其功能；（4）转化定义及方法（dmso、mncl2、tb aq、peg）等。（四）重组dna的转化及重组子的鉴定将外源dna分子导入某一宿主细胞的过程称为转化。把重组dna分子导入到细菌中产生克隆有两个目的，一是大量产生重组dna分子，在完成连接反应后，重组dna分子往往只有纳克级的量，不易操作和进行下一步的

5、分析，若把重组dna分子导入到细菌细胞中，细菌细胞可分裂多次产生克隆，克隆中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组dna分子，这样重组dna分子的量就多了；二是对重组dna分子进行纯化，在构建重组dna分子的过程中很难保证体系中不污染其他的dna分子，连接过程完成以后体系中有多种分子存在，除了需要的重组dna分子以外，还含有没有连接上的载体分子、没有连接上的dna片段、自身环化的dna分子和连接上污染dna片段的重组dna分子，未连接上的载体和dna片段对实验影响不大，因为它们即使导入细菌细胞，因为不能复制，很快就要被细菌细胞中的酶降解掉；对克隆工作带来影响的是后两种分子，因为它们都为环状，在细菌细

6、胞中都能复制，因而都能产生克隆，但是每个细胞中只能导入一个质粒dna分子，每个单克隆都是由一个细胞形成的，因此在每个克隆中所有的细胞都只含有同一种质粒。所以只要对不同的克隆进行筛选，就可以鉴定所需的重组dna分子。精品.所谓的重组子（recombinant）也叫做转化子（transformant）是指吸收了重组dna分子的转化细胞。将重组子从其它细胞群中（如上面提到的对克隆影响较大的自身环化的dna分子和连接上污染dna片段）分离出来，并鉴定无性繁殖的外源基因确实为目的基因，这过程称为筛选（screening）。根据载体体系、宿主细胞的特性以及外源基因在受体细胞表达情况的不同，初步把筛选方法分

7、为直接筛选和间接筛选，直接筛选法又可进一步分为dna鉴定筛选法、选择性载体筛选法、分子杂交选择法；间接筛选也可以进一步分为免疫学方法、mrna翻译检测法；本试验采用平板筛选法中的蓝白筛选法。相关知识点：转化（transformation） 质粒（plasmid）转染 (transinjection) 噬菌体（phage）显影注射（1）导入的方法 电转化 2.5kv基因枪 geneblaster脂质体介导法 其它方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法（2）重组子： 转化子（3）重组反应体系中的成分：（4）筛选的方法dna鉴定筛选法：定位、测序直接筛选法选择性载体筛选法：ph包裹、抗药性 -互补分子杂

8、交筛选法：ish、southern blot免疫化学免疫学方法间接筛选法酶免疫检测mrna翻译检测法（五）质粒dna的提取（碱裂解法）原核生物没有真正的细胞核，dna一般位于一个类似“核”的结构称为类核体上（因为不是一个完整的细胞核）。e.coli的遗传物质主要是染色体dna ，e.coli的染色体为双股环状dna，含有1 精品.400个以上的基因，另外还有一些质粒dna。1、质粒的概念质粒是细菌（如e.coli）染色体外的小型环状双链dna分子。一般说来，质粒不是细菌生长繁殖所必须的结构，就细胞生存而言，质粒是可有可无的。质粒分子本身含有复制功能的遗传结构，故能在细菌内独立地进行复制，并在细

9、胞分裂时恒定地遗传给子代细胞。2、研究质粒的意义（1）质粒作为一种裸露的，比病毒更简单、更有自主复制能力的dna分子，正好处于生命与非生命的分水岭上。由于质粒能够复制、能够传递、能够表达其遗传信息，说明质粒是独立的有机体，是亚细胞生命体系的成员，是比病毒更简单的原始生命形态，所以质粒是研究生命起源的一块重要的基石。（2）要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具。携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体。由于质粒具有遗传传递和遗传交换的能力，因此，质粒作为基因工程的重要运载工具，在现代分子生物学占有重要地位。3、质粒的分类 不同的质粒在宿主细胞中的拷数也不同，根据质粒在细胞

10、中拷贝数的多少，rownd（1969）把质粒分为严密型质粒和松弛型质粒。 （1）严密型质粒（stringent plasmid）：严密型质粒多半是一些具有自身传递能力的大质粒，其dna的复制与宿主染色体dna的复制相偶联，受到某种程度的控制，每个细胞仅有1-2个拷贝。（2）松驰型质粒（relaxed plasmid）：松驰型质粒多半是分子量较小、不具传递能力的质粒，其复制是在松驰控制下进行的，每个细胞的拷贝数约为10200个。当向培养基中加入氯霉素时，细胞的蛋白质合成被抑制，细胞染色体dna和严密型质粒dna的复制停止，松驰型质粒dna的复制继续进行。松驰型质粒dna的拷贝数可达数百个，基因工

11、程中使用的质粒都是松弛型质粒。相关知识点：（1）质粒的分类：与宿主相关程度：严密型质粒（stringent plasmid）、松弛型质粒（relaxed）是否有转移基因：接合型质粒、非接合型质粒带有特殊用途的基因：生殖质粒（f质粒）、抗性质粒（r-质粒）、col质粒（编码杀死其他细菌的蛋白质）、降解质粒、致病质粒（ti）oclsc（2）质粒的提取方法：煮沸法、cscl、试剂盒、碱裂解法；（3）质粒的构型： sc构型：cccdna (covalently closed circle dna) oc构型：ocdna (open circle dna) 精品.l构型：l-dna (lineardna

12、)三、实验原理（一）t载体的制备xcm是一种型的限制性核酸内切酶，其识别序列为：5-ccannnnnnnnntgg-33-ggtnnnnnnnnnacc-5其中阴影部分为xcm的识别序列，“”为xcm的切割位点，其识别序列中间的9个任意核苷酸（n）对xcm的酶切特异性及酶切效率没有影响。为了能得到用xcm酶切后3末端均是t的载体，本实验利用了xcm的识别序列的特点，引物的3端带有xcm酶切位点，其序列如下：primer1：5-cgcccatgctagcgctggtaat- 3primer2：3- tctctaaggtatgcatatgacccgc- 5引物中“”为xcm的切割位点，当xcm对p

13、cr得到的线性片段进行酶切的时候，便会产生一个与t载体形式完全一样的3-t粘性末端。（二）dna的重组与连接（pcr产物的克隆）1988年，clarke发现所有的pcr产物都在taq dna聚合酶的作用下在3端附加上了一个3突出的腺苷酸，因为精品.taq dna聚合酶具有非模板介导的核苷酸转移酶活性，可在双链dna末端加上一个单一的3突出的datp，利用taq dna聚合酶的这一特性，在克隆载体上附加3胸腺嘧啶（dttp）形成t-a克隆系统，即可直接对pcr产物进行有效的克隆，这样的载体称为t-载体。（三）大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备技术是从20世纪70年代初期发展起来的，

14、当时人们发现如果把e.coli细胞浸在一冰冷的盐溶液，它吸收dna分子的能力要比不浸的细胞强；经过摸索和总结，人们终于采用50 mmol/l的氯化钙（cacl2）溶液来制备感受态细胞。其他的盐（如氯化铷rbcl）也很有效。尽管对这一处理的确切机制仍不清楚，但有人对感受态提出了两种假说，一种认为是细菌细胞壁的局部失去了壁结构或局部溶解，让外源dna分子通过质膜进入；另一种认为dna分子能进入细菌细胞是由于细胞处于感受态时表面形成了一种可接受dna的酶位点。一旦细胞被处理制备成感受态细胞，它们就能稳定地摄取外源dna分子了。（四）重组dna的转化及重组子的鉴定转化是使重组体dna分子在热休克的短暂

15、时间内被导入受体。一般认为dna分子在转化过程中将经历四个阶段，第一个阶段是吸附阶段，完整的双链dna分子将吸附于感受态细胞的表面；第二个阶段为转入阶段，双链dna分子解链，以单链的形式进入细胞，而另一链则被降解；第三阶段是自身稳定阶段，外源质粒在细胞内又复制成双链环状dna；第四个阶段是表达阶段，即目的基因随同质粒的复制子一起复制。有些株系的e.coli尽管用抗生素抗性基因的插入失活法来筛选重组子很方便，但有的质粒还是采用了其他基因进行筛选，效果同样不错。以pc 8载体为例，它除了含有氨苄青霉抗性基因以外，还含有一个称为lacz的基因。该基因编码-半乳糖苷酶的一部分。半乳糖苷酶参与的将乳糖分

16、解成葡萄糖和半乳糖的生化过程，本来是由e.coli染色体上的lacz基因编码。有些株系的e.coli带有修饰过的lacz 基因（即缺少lacz的lacz基因），只编码-半乳糖苷酶的-肽。这些株系的e.coli细胞只在有吸收了像pc 8这样带有lacz基因的质粒分子的情况下才能够合成完整的-半乳糖苷酶。因此在筛选pc 8的重组子时，先将转化子涂布于含有氨苄霉素的培养基上培养，然后再通过检测-半乳糖苷酶的活性来选择重组子，既能抗氨苄霉素，又能合成-半乳糖苷酶的细胞就是重组子细胞。现代化学的发展给我们提供了非常直接地检测-半乳糖苷酶活性的方法，这种方法涉及一种乳糖的类似物5-溴-4-氯-3-吲哚-d

17、-吡喃半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-d-galactopyranoside），因为它的英文名太长，所以人们就用x-gal来代替它的长名。-半乳糖苷酶可以将x-gal 分解成一种深蓝色的产物，这个反应是很灵敏的。当带有氨苄青霉素的培养基中加有x-gal及一种-半乳糖苷酶的诱导物（异丙基-d-硫代半乳糖苷，iptg）时，那些能合成完整-半乳糖苷酶的未重组克隆就会因它能酶解x-gal而变成深蓝色，而重组子因lacz基因被破坏不能合成完整的-半乳糖苷酶而呈白色，蓝白分明，重组子的筛选也已泾渭分明。精品.e.coli 修饰过的puc系列质粒 修饰的lacz基因 多lac

18、z基因（缺少lacz基因） -半乳糖苷酶c末端-肽 -半乳糖苷酶n末端-肽 完整的-半乳糖苷酶 x-gal/iptg 深蓝色（五）质粒dna的提取（碱裂解法）碱裂解法是一种用得最广泛的制备质粒dna的方法，是当今分子生物学研究中的常规作法。碱变性法抽提质粒dna是基于染色体dna与质粒dna的变性与复性的差异而达到分离目的，当细胞在有naoh和sds（十六烷基磺酸钠）的溶液中裂解时，蛋白质与染色体、rna、dna发生变性，加入中和液醋酸钾溶液后，溶液变成中性，质粒dna复性，质粒dna以原来的构型保存在原溶液中，进行离心，蛋白质与染色体dna随细胞碎片沉淀下来，质粒dna则留在上清液中。这种方

19、法主要用于从小量培养物或同时从许多细胞克隆中进行dna提取，比较方便和省时，该法提取的dna纯度较高，不需进一步纯化即可满足测序、pcr等。（1）solution：破坏细胞壁。（2）solution：高ph值，sds使宿主染色体dna和蛋白质变性。（3）solution：乙酸钾中和质粒dna复性、染色体dna不复性，仍和变形蛋白质缠绕成大的复合物。四、实验过程（一）t载体的制备1、pycq1载体的质粒提取（1）挑取含有质粒pbi121的大肠杆菌单菌落，接种于50ml lb（含amp抗生素60g/ml）液体培养基中，37，180 r/min振荡培养过夜（约12-14h）。（2）取适量培养物加入离

20、心管中，室温8 000 r/min离心4 min，弃上清，收集菌体。（3）将100l预冷的溶液i加入到离心管中，在旋涡混合器上剧烈振荡，使菌体分散混匀。精品.（4）加入溶液ii（1%sds 100l，0.2 mol/l naoh 100l），快速颠倒10次混匀（不要剧烈振荡）。（5）加入150l预冷的溶液iii，将管缓慢颠倒数次混匀并冰上放置5min后，4 12 000 r/min，离心4min。（6）少量多次吸取上清转移至新管，小心不要引入白色的蛋白质污染。（7）加入400l预冷的苯酚氯仿异戊醇（25：24：1），上下颠倒，去除蛋白质，4 12 000 r/min 离心5min。（8）小心移

21、出上清于一新1.5ml离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后冰置10min，以沉淀质粒dna 。4 12 000 r/min离心3min。（9）弃上清，用200l预冷的70%乙醇洗涤沉淀，12 000 r/min离心3min，去上清，滤纸吸干多余液体，固体在室温下放置无乙醇味。（10）获得的质粒载体pycq1沉淀溶于25lddh2o，-20保存备用。2、pcr扩增反应取一支0.2mlpcr管，冰上建立pcr反应体系，pcr反应液按表1进行配制。表1 pycq1载体的pcr反应体系成 分用 量ex taq buffer2.5lddh2o 17.5ldntp（2.5mmol/l）1.5lp1（1

22、0 mol/l）1.0lp2（10 mol/l）1.0l模板（质粒载体pycq1）1.0lex taq酶0.5ltotal volume25l扩增程序：94 2min；94 0.5min，5060 0.5min，72 1.5min，30个循环；72 4min，4保存。3、xcmi单酶切pcr产物取一支0.2mlpcr管，冰上建立酶切反应体系，酶切反应液按表2进行配制。表2 xcm酶切反应体系成 分用 量xcm buffer2.5lpcr扩增产物16.5lxcm0.5l精品.ddh2o5.5ltotal volume25l加封口膜后才可放入水浴锅中，37水浴2.5h。酶切后，65水浴10min终

23、止酶切反应。（二）dna的重组与连接（pcr产物的克隆）4、与pcr产物连接取一支0.2mlpcr管，冰上建立连接反应体系，连接反应液按表3进行配制，16水浴1h。表3 连接反应体系成 分用 量 10t4 dna ligase buffer1.0lddh2o2.0lbvm14-glyi基因5.0l载体（xcm酶切产物）1.0lt4 dna ligase1.0ltotal volume10l（三）大肠杆菌感受态细胞的制备5、dh5感受态细胞的制备（1）从37培养的平板中挑取一个dh5单菌落，接种于50ml lb液体培养基中，37 180 r/min振荡过夜。（2）次日按1%的量（500l）接种于

24、50ml lb液体培养基中，37180 r/min振荡培养1h 40min。（3）将菌液分装于10ml离心管中，4 000 r/min 4离心5min，去上清，收集菌体，加入5ml预冷的0.lmol/l cacl2。轻轻悬浮沉淀，置冰上30min。（4）4 000 r/min离心5min，去上清，加入1ml预冷的0.1 mol/lcaci2，轻轻悬浮沉淀。（5）进行分装，每一个1.5ml离心管中加约200l的感受态细胞，4保存备用。（四）重组dna的转化及重组子的鉴定6、连接产物转化dh5感受态细胞（1）10l连接产物和200l感受态细胞在无菌条件下混匀，冰置30min。（2）42水浴热激90

25、s，立即放置冰上90s。（3）加入890l 已预热至37的soc液体培养基，37扩培，180 r/min振荡l h。（4）振荡培养后，将菌液按不同梯度的量涂布于含有x-gal（40l）、iptg（4l）的lb（amp 60 g/ml)平板。（5）待菌体吸附后（约15min），倒置于37 恒温培养箱中培养过夜（约14-16h），观察菌落颜色，计算转化效率。精品.（6）挑取重组菌落，接种至1.5ml离心管（含1ml lb+amp液体培养基）中，扩培备用。（五）质粒dna的提取（碱裂解法）（1）步骤同（一）中的质粒的提取步骤。（2）将提取的质粒进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结束后凝胶成像系统拍照

26、，检测重组质粒是否构建成功。五、实验要点（一）t载体的制备、dna的重组与连接（pcr产物的克隆）因为本试验使用的载体为t载体，所以不需要插入片段与载体的同时酶切。如果需要在酶切反应之后再进行连接反应时，应注意以下两点：（1）限制性内切酶未能完全被灭活，使用乙醇沉淀可避免这一问题的发生。（2）dna样品中混有可影响连接活性的杂质，酶解后的dna直接用于连接时而不经过乙醇沉淀重溶于无菌蒸馏水中时常常会碰到这种问题。（二）大肠杆菌感受态细胞的制备1、商品化的感受态细胞有ph 525、jb 101、top 10、dh 5-2。2、对所用试剂如cacl2的要求很高，要注意质量与浓度。3、用cacl2法

27、制备的感受态细胞在4放置过夜后感受态效率提高。4、感受态细胞对冻融非常敏感。化冻的细胞不应重复冷冻，如果冰箱出了故障则应弃去并重新制备。（三）重组dna的转化及重组子的鉴定1、通常蓝色显色不太完全，可以将平板置于冰箱中放置过夜使颜色变深。2、实验中应作对照，通常对照是取部分感受态细胞，用未酶解的载体质粒进行转化，应该得到一块长满蓝色克隆的平板，证明感受态细胞是好的。3、除对照外，如果其他板上一个菌落也没有。出现这种问题的原因可能是连接酶失活，应当更换。4、平板上的菌长成菌苔状，出现这种情况可能有如下两个原因：（1）对未转化的e.coli细胞缺乏选择压力，使它们同转化细胞一起生长，其原因是平板中

28、缺乏抗生素或抗生素活性较低，在培养基未能充份冷却时即加入抗生素可能导致抗生素部分失活。（2）e.coli菌株可能获得了含有抗生素抗性基因的质粒。这时应使用新鲜氨苄青霉素重新配制lb平板，同时配制不含抗生素的平板，将贮存的细菌分别涂在两种平板上，若该菌株能在含有氨苄青霉素的平板上生长，则说明该菌获得了某个质粒，应弃之，并且制备新鲜菌；若细菌在不含抗生素的平板上生长，在含氨苄青霉素的平板上不能生长，则说明在转化实验中所使用的平板或者没加抗生素，或者抗生素浓度不够。精品.（五）质粒dna的提取（碱裂解法）加入溶液进行蛋白质的变性过程中要记住两点：（1）时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组dna

29、的断裂会慢慢断裂；（2）必须温柔混合，不然基因组dna也会断裂，这样会带来很多麻烦。六、实验仪器及耗材1、实验仪器：水浴锅、摇床、高压灭菌锅、无菌操作台、移液枪、冻冷离心机、紫外分光光度计（721型）、离心机、移液管、超低温冰箱、电子天平、接种环、涂布棒、冰浴、培养箱、振荡器 （vortex）、饭盒、玻璃器皿（三角瓶、平皿）、试管、制冰机、冰盒、计时器、磁力搅拌器。2、耗材：0.2ml pcr管、0.5ml离心管、1.5ml 离心管、10ml离心管、液氮（罐）、一次性手套、滤纸、沙布、脱脂棉、tip头（各种大小）。七、实验主要试剂及配制方法（一）实验主要试剂1、t载体的制备 amp抗生素、胰化

30、蛋白胨、酵母提取物、nacl、naoh、sds、苯酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）、异丙醇、乙酸钾、冰乙酸、70%乙醇、氯霉素、引物、ex taq酶、dntp、xcm酶、buffer、ddh2o。2、dna的重组与连接（pcr产物的克隆）pcr产物（插入dna）、pmd20-t载体（大连宝生物生产）、ddh2o、t4 dna连接酶、buffer。3、大肠杆菌感受态细胞的制备胰化蛋白胨、酵母提取物、无菌水、nacl、naoh、top10菌种、dh5菌种、葡萄糖、cacl2。4、重组dna的转化及重组子的鉴定pcr产物连接混合物、感受态细胞、合适的对照dna、lb培养基（每升中含有 10g胰蛋白

31、栋、5g酵母浸膏、10g nacl，用5m naoh调节ph7-8）、lb氨苄青霉素平板（每升lb培养基中加入15g琼脂，再加入氨苄青霉素至终浓度为100g/ml）、氨苄青霉素（用灭菌蒸馏水配制50mg/ml的贮液）、iptg（取2g溶于8ml双蒸馏水中，定容至10ml，过滤除菌，-20保存）、x-gal（贮液浓度为20mg/ml，溶于二甲基甲酰胺中，-20暗处保存）、soc培养基。5、质粒dna的提取（碱裂解法） 胰化蛋白胨、酵母提取物、nacl、naoh、氯霉素（34mg/ml，溶于乙醇，工作浓度为170g/ml）、hb 101大肠杆菌菌株、葡萄糖、trishcl、edta-na22h2o

32、、sds、乙酸钾、冰乙酸、乙醇、无菌水、精品.（二）配制方法1、lb液体培养基（不加抗生素）去离子水950m胰化蛋白胨 10g母提取物 5gnacl 10g摇动至完全溶解，用5mol/l naoh（约0.2ml）调ph至7.0，加入去离子水至总体积为1l，在151bf/in2（1.034105pa）高压灭菌20min。2、0.1m cacl2配制 cacl22.3g 加h2o至200ml（灭菌）3、5mol/l naoh（naoh分子量=40）将200gnaoh溶于450mlh2o中，加水定溶至1l。4、lb培养基（lria-bertani培养基） 去离子水 950ml细菌培养用胰化蛋白胨（bacto-tryptone） 10g细菌培养用酵母提取物（bacto-yeast extract） 5gnacl 10g摇动容器直至完全溶解，用5mol/l naoh（约0.2ml）调节ph值至7.0，加入