6种检测方法ppt课件

1、.,高效液相色谱六种定量方法原理及使用条件,.,六种定量方法,1、峰面积百分比法 2、峰面积归一法 3、外标法 4、杂质检查法 5、内标法,加校正因子的主成分自身对照法,不加校正因子的主成分自身对照法,.,峰面积百分比法,按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。 某化合物百分含量（%）= 简单的说就是配制溶液，进样，按峰面积百分比法读取含量。一般系统适应性主要考察分离度。（如：双乙酰阿昔洛韦。D-NAP方法，P4）,峰面积,峰面积,100%,.,优点： 快速、简单、无需考察系统重复性（

2、进样量不严格）无需对照品 缺点： 测定误差大，本法通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。,峰面积百分比法,.,峰面积归一法,在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液（一般为100%限度加样溶液），进样，记录色谱图，按 式中：Ci加样溶液中加入的杂质百分含量； Ai1回收异丙醇中杂质的平均峰面积； Ai2加样溶液中杂质的峰面积； Cs加样溶液中主成份的百分含量； As加样溶液中主成份的峰面积。 计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。这些需作校正计

3、算的杂质，通常定位或以主成分为参照，采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种项下。,.,峰面积归一法,按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图。测量各峰的面积，加入校正因子计算各组分面积及总峰面积。计算各组分折算后峰面积占总峰面积的百分比。 公式如下： 某化合物百分含量（%）= 比面积百分比法多了一步校正因子计算。如双乙酰阿昔洛韦。 若杂质含量较少，乘校正因子对总面积影响较小，可按结果校正因子报告。 若杂质含量较大或个数较多，乘校正因子对总面积影响较大，需按峰面积乘校正因子重新计算总峰面积后再计算。（如：vcv 有关物质2等）,峰面积响应因子,峰面积响应因子,100%

4、,.,优点： 快速、简单、无需考察系统重复性（进样量不严格）验证时需对照品，之后无需对照品。 缺点： 同峰面积百分比法。误差较大， 但比百分比法准确。,峰面积归一化法,.,外标法,建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量： 含量（% ）=（CR/CX）(AX/AR)*100 式中CR对照溶液中待测组分浓度； CX供试品溶液中待测组分浓度； AX 供试品溶液中待测组分浓度； AR 对照溶液待测组分峰面积。 系统适应性中需考察重复性。 基本原理：浓度和峰响

5、应成线性。（如各产品项下含量方法，CPG BSA杂质A、基因毒性杂质等）,.,外标法,优点： 外标法方法相对内标法简便，不需用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待测组分定量准确。对照品好找，用待测组分的纯品作为对照品。 不足： 1、进样量必须准确。此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中成分或杂质含量时，以定量环或自动进样器进样为好。 2、仪器及人员精密度要求较高。需控制实验条件稳定性。 3、定期校正。 4、只能每个待测组分均需进其对照溶液。 但此外，为了降低外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中

6、组分的浓度相近。,.,杂质检查法,1、 加校正因子的主成分自身对照法 已知且有对照品杂质 2、不加校正因子的主成分自身对照法 未知或无对照品杂质 已知杂质且有对照品的我们现在都加校正因子，未知杂质按1.0计。 除另有规定外，校正因子大于等于1.0时，保留至小数点后1位，反之，保留至小数点后两位；结果为0.801.2之间，通常按1.0计，反之，杂质浓度计算时，应乘以测试得到的校正因子。,.,加校正因子的主成分自身对照法,在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，或根据线性检测结果计算。 f= 或f= 计算杂质的

7、校正因子。此校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。这些需作校正计算的杂质，通常以主成分为参照，采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种项下。,A杂/C杂,A样/C样,K样,K杂,.,加校正因子的主成分自身对照法,需系统适应性考察： 1、灵敏度考察：定量限最低要求在杂质一半限度以下。（可调节进 样浓度或进样量） 2、系统适应性考察：通常含量低于0.5%的杂质，峰面积的相对标准 偏差（RSD）应小于10%；含量在0.5%2%的杂质，峰面积的 RSD应小于5%；含量大于2%的杂质，峰面积的RSD 应小于2% 3、供试品溶液的记录时间，除另有规定外，一般为主成分色谱峰保留时间的2倍

8、。 方法确定后不调节。,.,加校正因子的主成分自身对照法,测定杂质含量时，进样自身对照溶液（自身对照溶液：供试品溶液稀释至主成分浓度一般为杂质限度浓度） 测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。 公式为： 杂质含量（%）= 式中：AIM 待测杂质峰面积； C对 自身对照溶液中供试品浓度； A对 待测杂质峰面积； C供试品 供试品浓度； f 校正因子。,Aim*C对,A对*C供试品,*f*100,.,不加校正因子的主成分自身对照法,测定杂质含量时，若没有杂质对照品，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。 基本除校正因子步骤

9、外，其余同加校正因子自身对照法,.,杂质检查法,优点： 相对较准确。首次验证时用相应对照品确定校正因子后，样品检测时只要用供试品作为对照品。只需定位溶液或RRT定位。节省杂质对照品有关物质检测溶液配制简单。 缺点 同外标法，需较高的仪器人员环境稳定性。 若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品的色谱图1，再记录等体积纯溶剂的色谱图2.色谱图1上杂质峰的总面积（包括溶剂峰），减去色谱图2上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。 即扣除空白溶剂法。,.,杂质检查法,与外标法区别 外标法：对照和待测组分为同一物质，只能校正进了对照溶液的组 分。（主成分对应主成分对

10、照，杂质对应杂质对照） 自身对照法：对照一般为待测供试品。（所有待测组分均对应主成分 对照） 如：阿昔洛韦USP有关物质中鸟嘌呤为外标法。其他杂质为自身对照法。,.,内标法,1、原理 按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子f： f= 式中：As 为内标物质的峰面积或峰高；Ar 为对照品的峰面积或峰高； Cs 为内标物质的浓度； Cr 为对照品的浓度。 f 即内标物质与待测样品响应比值。 需考察仪器响应重复性。即校正因子重复性。,As/

11、Cs,Ar/Cr,.,内标法,再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量CX： Cx=f* = * 式中：Ax 为供试品峰面积或峰高； Cx 为供试品的浓度； As 为内标物质的峰面积或峰高；Cs 为内标物质的浓度； f为校正因子。,Ax,As/Cs,As/Cs,Ar/Cr,Ax,As/Cs,.,内标法,1、优点： 、在进样量不超限(色谱柱不超载)的范围内， 采用内标法（因为采用同一针比值来计算），定量结果与进样量的重复性无关。 、只要被测组分及内标物出峰，且分离度合乎要求，就可定量，与其他组分是否出峰无关。 、很适用于测定药物中微量有效成分或杂质的含量。由于杂质(或微量组分)与主要成分含量相差悬殊，无法用归一化法测定含量，用内标法则很方便。加一个与杂质量相当的内标物。加大进样量突出杂质峰，测定杂质峰与内标峰面积之比，即可求出杂质含量。 第1条主要针对外标法。 2,3两条主要针对面积归一化法。因组分浓度太小时不能检出，组分浓度太高时不能呈线性。,.,内标法,2、不足： 因内标物选择需符合以下要求: （1）内标物是原样品中不含有的组分，否则会使峰重叠而无法准确测量内标物的峰面积； （2）化学性质与样品相似 （3）内标物必须是纯度合乎要求的纯物质。 （4）与样品有相似响应值 （5）不会与样品发生反应