分子生物学实验报告材料

1、分子生物学实验报告分子生物学实验报告 专业：* 班级：* 指导老师：* 学生姓名：* 目录：目录： 实验一 质粒 DNA 的小量制备 实验二 DNA 的含量、纯度与分子量的电泳法测定 实验三 感受态细胞的制备及转化 实验四 PCR 扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测 2010.05.29 分子生物学基础实验分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。 为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物 学实验技术。它的内容包括质粒 DNA 的制备；DNA 的重组；PCR 基因扩增等等。 实验一实验一

2、质粒质粒 DNADNA 的小量制备的小量制备 一、实验原理一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带 外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector） 。载体的设计和应用是 DNA 体外重组的重要条件。 作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因 复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增； （3）载体 DNA 链上有 1 到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载 体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（

3、Tcr） ，抗新霉素基因（Ner）等，以此知道它是否已进 入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它 是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在 1120kb 之间，具有双链闭合环状结 构的 DNA 分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细 胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌 染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（

4、stringent control）和松弛控制型 （relaxed control） 。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个 细胞内只含有 1 个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷 贝，一般在 20 个以上。通常大的质粒如 F 因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如 ColE 质粒（含有产生大肠杆菌素 E1 基因） ，拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑 制剂氯霉素时，染色体 DNA 复制受阻，而松弛型 ColE质粒继续复制 1216h，由原来 20 多个拷贝 可扩增至 10003000 个拷贝，此时

5、质粒 DNA 占总 DNA 的含量由原来的 2增加到 4050。本实验 分离提纯化的质粒 pBR322、pUC19 就是由 ColE 衍生的质粒。 所有分离质粒 DNA 的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯 化质粒 DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离 子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体 DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒 DNA 则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒 DNA。 质粒 DNA 的相对分子量一般在 106107范围内，如质粒 pBR322 的相对分子质量为 2.8

6、106，质粒 pUC19 的相对分子质量为 1.7106。在细胞内，共价闭环 DNA（covalently closed circular DNA，简 称 cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除 链的张力，这种松弛型的分子叫做开环 DNA（open circular DNA，简称 ocDNA） 。在电泳时，同一质粒 如以 cccDNA 形式存在，它比其开环和线状 DNA 的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒 DNA 在电泳 凝胶中呈现 3 条区带。 二、实验目的二、实验目的 1掌握最常用的提取质粒 DNA 的方法和检测方法。 2了解制备原

7、理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂三、实验材料和试剂 材料：大肠杆菌E.coli，含 pBR322 质粒。 试剂： 1. LB 培养基：10g/L 胰蛋白胨，5g/L 酵母提取物，10g/L NaCl，用 NaOH 调 pH 至 7.3 左右。如固体 培养基则添加 15g/L 琼脂。 2. 溶液（pH8.0G.E.T 缓冲液）：50 mmol/L 葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA。灭菌后 存放。 3. 溶液（0.2mol/LNaOH(内含 1SDS)）：预先配制 1SDS 母液，临用前一天晚上加入 0.2mol/LNaOH，4保存。 4. 溶液（pH4

8、.8 乙酸钾溶液）：5mol/L 乙酸钾 60mL、冰乙酸 11.5mL、双蒸馏水 28.5mL。 5. 酚/氯仿液(V/V1/1)：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中加入异戊醇，使其体积比为 24:1，然后 等量的加入重蒸酚，混匀，并用 0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，于棕色 瓶中存放，并在上面覆盖等体积的 0.01 mol/LTris-HCl(pH7.6)，4保存。 6. 无水乙醇 7. 70乙醇 8. pH8.0 TE 缓冲液：10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA，其中含 RNA 酶 20g/mL。 仪器： 恒温培养箱、恒温摇床、

9、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、EP 管(1.5mL 微量离心管)、加样器(20uLlmL)、吸头。 四、操作步骤四、操作步骤 （一）培养细菌 将带有质粒 pBR322 的大肠杆菌接种在含 50g/mL 氨苄青霉素(Amp)的 LB 液体培养基中，37振 荡培养过夜。注意：添加 Amp 时，须待 LB 培养基冷却到 50左右方可加入。 （二）从菌落中快速提取制备质粒 DNA 1取 1.4mL 菌液置于 1.5mL Ep 管中，7500rpm 离心 1min。 2弃上清，加入 150L GET 缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀，在室温下放置 10min。 3加入 200

10、L 新配制的 0.2mol/L NaOH(内含 1SDS)，加盖，颠倒（不要振荡）23 次，使之混匀， 冰上放置 4min，最多不能超过 5min。 4加入 150L 冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒数次使之混匀，冰上放置 15min。 54，10000rpm 离心 5min，上清液吸至另一干净的 1.5mL Ep 中，如上清液浑浊则需重新离心一次。 6于上清液中加等体积酚/氯仿液，振荡混匀，4，12000rpm 离心 2min，小心吸取上清液，转移至 另一 1.5mL Ep 管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。 7向上清液加入 2 倍体积无水乙醇，混匀，室温放置min。用离心机于 10

11、000rpm 离心 5min。小心吸 去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。 8用 0.5mL 70乙醇洗涤沉淀一次，10000rpm 离心 3min，除尽乙醇，室温自然干燥(将离心管倒置于 一张纸巾上)，备用。 9用 25uL 含无 DNA 酶的胰 RNase(20 ugmL)的 TE 重新溶解 DNA，置于 4保存，供下午电泳使用。 贮存于-20备用，可长期保存。 五、注意事项五、注意事项 1收集菌体提质粒前，培养基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。 2在添加溶液与溶液后溶液的混合一定要柔和，采用上下颠倒的方法，千万不能在旋转器上剧烈 振荡。其中加入溶液后，溶液变

12、成澄清，并有黏性；加入溶液后，出现絮状沉淀。 3苯酚具有腐蚀性，能造成皮肤的严重烧伤及衣物损坏，使用时应注意。如不小心皮肤上碰到苯酚则 应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。 4苯酚可以用于抽提纯化 DNA，由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。所使用的苯酚在使用前 必须经过重蒸，且都必须用 0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)进行平衡。所以取酚/氯仿/异戊醇时应取 下层溶液，因为上层是 Tris-HCl 液隔绝空气层。 5酚/氯仿/异戊醇抽提时，应充分混匀。经酚/氯仿/异戊醇抽提后，吸取上清液时注意不要把中间的 白色层吸入，其中含有蛋白质等杂质。 6实验中，涉及酚/氯仿溶液的操作

13、要格外小心，而且与之接触的吸头、Ep 管，全部弃用，不回收。 7有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在，但经过多次移接有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转 接，每次接种时应挑单菌落。 六、思考题六、思考题 1裂解细菌时需注意的事项有哪些？ 答：注意不能震荡，防止细菌 DNA 断裂，混到质粒里面去，导致提取的质粒不纯。 2质粒的基本性质有哪些？ 答：质粒的性质：原指一切独立于染色体外的遗传因子，但目前一般指微生物细胞中的染色体 外遗传因子。它们是能自主复制的共价、闭合、环状的 DNA 分子，整个质粒通常编码若干个基因。由 于质粒的存在往往可以使宿主细胞具有某些性状，而质粒的丢失并不影响宿主在正常条件

14、下的生存。 由质粒授予宿主的表型有抗生素耐药性的、产抗生素的、降解芳香族化合物的、产溶血素的、糖发酵 的、对重金属耐受性的、产杆菌素的、植物肿瘤诱发的和产硫化氢的。根据质粒的复制类型分为松弛 型复制(胞内维持高拷贝数，从几个到几十个)和严聚紧型复制(胞内仅 13 个拷贝)。一部分质粒可通 过细菌细胞的接触而转移，使一些对药物敏感的细胞获得对某些药物、金属离子的耐受性或使受体细 胞获得另一些特性。在基因重组技术中，有些质粒可用作基因载体。现在应用的载体基本上是在质粒 的基础上改造而成的。 3、碱裂解法提取质粒 DNA 中各溶液的作用是什么？ 答：各溶液的作用如下： 溶液 葡萄糖增稠，使悬浮后的大

15、肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制 DNase 的活 性。这一步溶液中还可以加入 RNase，不受 EDTA 影响，并且可以在后续步骤中被除去 溶液 0.2M NaOH / 1% SDS破细胞的主要是碱，而不是 SDS，所以才叫碱法抽提。 溶液 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸这一步的 K 置换了 SDS（十二烷基磺酸钠）中的 Na，得到 PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS 易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子，钾钠离子 置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组 DNA 也被 PDS 共沉淀 4、抽提质粒 DNA 的方法包括哪几个步骤？ 答：D

16、NA 提取分为三个基本步骤： 1、 破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。 2、醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与 DNA 结合的组蛋白。 3、将 DNA 在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为 DNA 在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。 5如何提高质粒 DNA 的产量？ 答：提取方法都是大同小异的，只要操作上注意量都不会差别很大。所以主要还是看菌液的状态。 如果想抽多一些，就摇多些菌液，一般如果是大质粒，用 5ml 以上菌液摇，多次离心用一管收集， 相应增加溶液一二三的量即可。另外，一般认为，一般摇 16 个小时菌的生长状态比较好。 6为什么质粒 DNA 不能反复在 4、

17、-20、室温中放置？为达到这一目的，需要注意些什么？ 答： 将质粒 DNA 反复在 4、-20、室温中放置会导致环状的 DNA 的断裂成线性的分子，不能 得到环状的 DNA 分子。所以为了避免这一问题对于提取的 DNA 因根据使用其的时间不同而作区别地处 理：对于近段时间就要用的质粒 DNA 应置于 4冰箱中放置；而对于长时间不用的质粒 DNA，则应保存 在-20的冰箱中，因为在相对低的温度下质粒可以保存较长的时间。 实验二实验二 DNADNA 含量、纯度与分子量的电泳法测定含量、纯度与分子量的电泳法测定 一、一、实验原理实验原理 测定核酸通常采用两种方法：即紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳法。

18、 1紫外分光光度法 DNA 或 RNA 定量时，应在 260nm 和 280nm 两个波长下读数。根据计算在 260nm 波长下，每 1ug/mL DNA 钠盐的 A 值为 0.20，即在 A260=1 时，双链 DNA 含量为 50ug/mL，单链 DNA 与 RNA 含量为 40ug/mL， 单链寡核苷酸的含量为 33 ug/mL。 双链 DNA 含量A26050稀释倍数（ug/mL） RNA 含量A26040稀释倍数（ug/mL） 单链 DNA 含量A26033稀释倍数（ug/mL） 此外还可以根据 260nm 和 280nm 的读数间的比值（A260/A280）估计核酸的纯度。 2琼脂

19、糖凝胶电泳法 根据 DNA 分子量不同，采用外加电场使其分开，用 EB 嵌入 DNA 分子后在紫外下显荧光。而荧光强 度正比于 DNA 的含量，如将已知浓度的标准样品表 21 作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。 电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照，只需要 510ngDNA，就可以从照片上比较鉴别。 由于电泳时所用的样品量非常少，只要将浓度控制在几十纳克即可，所以在基因工程中经常被用 做检测 DNA 样品。 表 21 DNA/ Hind 中 DNA 片断 二、实验目的二、实验目的 1从以上实验中提取到的质粒 DNA，为了能作下一步的酶切，连接及转化实验，必须测定 DNA 的纯度、 含量

20、以及分子量大小。 2本实验旨在学习水平式琼脂糖凝胶电泳，学习检测 DNA、含量与相对分子质量大小。 三、实验材料和试剂三、实验材料和试剂 材料：自制的质粒 DNA、DNA/ Hind 、 。 试剂： 1标准 DNAmarker(DNA/ Hind ) 2限制性内切酶 EcoR或Hind和 10X 缓冲液 3酶反应中止液：0.2 5溴酚蓝(含 40蔗糖)，已配好。 4溴化乙锭染液（EB）：使用前稀释 1000 倍，母液已配好。注意：EB 是一种诱变剂，配制和使用时 应戴好手套，并且不能将该染液洒在桌面或地面上！使用后立即用大量的水冲洗干净。 50.5TBE 缓冲液：Tris 2.18g、硼酸 1

21、.10g、EDTA-Na20.14g 用蒸馏水定容至 400mL。可配成 5TBE 母液，使用时稀释 10 倍即可。 60.7琼脂糖 仪器： 37水浴锅、微波炉、稳压电泳仪、凝胶成像系统、电泳槽、Eppendorf 架、恒温摇床、台式小型 振荡器、Ep 管(1.5mL)、加样器(20uLlmL)、吸头。 四、实验操作四、实验操作 片段碱基对数目/kb相对分子质量DNA 含量/ %DNA 含量/(ng/mg) 123.13015.010647.7476.9 29.4196.1210619.4194.1 36.5574.2610613.5135.2 44.3712.84106989.9 52.32

22、21.511064.847.9 62.0281.321064.241.8 70.5640.371061.111.6 80.1250.081060.32.6 （一）质粒 DNA 的酶解 1新提的质粒，在 10uL 的体系中用单一酶（如 EcoR）进行处理，即： 质粒 DNA 5L 10缓冲液 1L EcoR 0.5L ddH2O 4L 237，保温 30min。 3加入 1/10 体积的酶反应终止液，混匀以停止酶解反应。各酶解样品于冰箱中贮存备用。 （二）琼脂糖凝胶板的制备 1琼脂糖凝胶的制备 称取 1.0g 琼脂糖，置于锥形瓶中，加入 100mL TBE 缓冲液，瓶口倒扣一小烧杯，于电炉上加热

23、， 注意：防止溢出，由于琼脂糖较难溶解，如果水分损失较大，则补充一定量的蒸馏水，使其终浓度为 1。 2胶板的制备 将有机玻璃内槽洗净、晾干。取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好，形成一个边脚模子。注 意：将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。 将有机玻璃内槽置于水平位置，放好样品槽模板(一般称之为梳子)，将冷却至 65左右的琼脂糖 凝胶，小心地倒在内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的 胶层。室温下静置 1h 左右，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔 开的样品槽。 将有机玻璃内槽放入电泳槽中，加入 0.5TBE 电泳缓冲

24、液，以盖过胶板为宜。 胶板内的样品小槽 3加样 用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避免交叉污染，各 样品用不同的吸头，以免造成限制酶被污染。加样时，吸头不要插入胶板内，防止碰坏样品槽周围的 凝胶面，每个样品槽的加样量不宜过多，本实验加样为 10uL 左右。(每块胶板需点一个 Marker，这里 即为 DNA/ Hind ) 4电泳 加完样品后应立即通电，进行恒压电泳。在低压条件下，线形 DNA 片段的迁移速度与电压成比例 关系，为了获得电泳分离 DNA 片段的最大分辨率，电场强度不应高于 5V/cm。 当溴酚蓝染料（蓝色）移动到距离胶板下沿约 12cm 处，停

25、止电泳。 5染色 将电泳后的凝胶浸入 EB 染液中，进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的 DNA 带。染色 20min 后，用大 量水冲洗。 6观察 在波长为 254nm 的紫外灯下，观察染色后的电泳凝胶。DNA 存在处显示出红色荧光条带。 用凝胶自动成像仪处理代替。 五、注意事项五、注意事项 1基因工程是微量操作技术，DNA 样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的正确性， 确认样品确实被加入反应体系。 2酶应在20冰箱中保存，取酶的操作必须严格在冰浴条件下进行，用完后立即放回20冰箱， 不要将酶在冰浴中放置过久，或放在高于 0以上的环境中，以防止酶失活。 3酶切加样次序为水、缓冲液和

26、 DNA，然后混匀。酶永远是最后加入的，如将酶直接加入浓缩的缓冲 液中会引起严重的失水。酶切反应体系的溶液加完后，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心 机甩一下，使溶液集中在管底，不要用振荡器。此步操作是整个实验成败的关键，注意防止错加、漏 加。 4为了避免交叉污染，各样品用不同的吸头，且每次取酶时务必换吸头，以免造成限制酶被污染。 5溴化乙锭是一种强烈的诱变剂，有毒性，使用含有这种染料的溶液时，应戴手套进行操作。勿将溶 液滴洒在台面或地面上，用后用水彻底冲洗干净。 六、思考题六、思考题 1简述 EB 显色的原理。 答：琼脂糖凝胶中 DNA 最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色，溴化

27、乙锭含有一个可以 嵌入 DNA 堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与 DNA 的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强 度的饱和溶液中，大约每 2.5 个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋 的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致 与 DNA 结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。 DNA 吸收 254nm 处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收 302nm 和 366nm 的光辐射。 这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的 590nm 处重新发射出来。由于溴化乙锭-DNA 复合物 的荧

28、光产率比没有结合 DNA 的染料高出 20-30 倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5ug/ml）时， 可以检测到少至 10ng 的 DNA 条带。 溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA 或 RNA） 。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小， 所以其荧光产率也相对较低。事实上，大多数对单链 DNA 或 RNA 染色的荧光时通过染料结合到分子内 形成较短的链内螺旋产生的。 2使用溴化乙锭时应注意什么？ 答：溴化乙锭是强诱变剂，具有高致癌性！没办法的,只能带手套和自己小心 ,而且做完之后要做 如下处理实验结束后，应对含 EB 的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。 (

29、1) 对于 EB 含量大于 0.5mg/ml 的溶液，可如下处理： 将 EB 溶液用水稀释至浓度低于 0.5mg/ml； 加入一倍体积的 0.5mol/L KMnO4，混匀，再加入等量的 25mol/L HCl，混匀，置室温数小时； 加入一倍体积的 2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。 (2) EB 含量小于 0.5mg/ml 的溶液可如下处理： 按 1mg/ml 的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置 1 小时； 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。 3说明不同电压对电泳结果的影响是什么 答：在低电压时，线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同 分子量

30、的 DNA 片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越 大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小，也会产生拖尾现象。但电压过低，DNA 移动速 度会很慢，电泳时间较长。所以实际做电泳实验时应根据不同 DNA 片段和实验要求选择合适的电压。 通常使用的电泳电压为 90120V。 4如何判断 DNA 的纯度？ 答：测定 DNA 浓度与纯度利用紫外可见分光光度计分别测定在波长 260nm 处、280nm 处 DNA 的吸光 率，然后计算其浓度与纯度。 对于纯的核酸溶液，测定 A260，即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量。核酸的比吸光 系数是指浓度为

31、1ug/ml 的核酸水溶液在 260nm 处的吸光率，天然状态的双链 DNA 的比吸光系数为 0.020，变性 DNA（即单链 DNA）和 RNA 的比吸光系数均采用 0.022。 DNA 纯度可以 A260/A280 的比值表示：纯的 DNA 样品比值为 1.8，纯的 RNA 样品比值为 2.0。核酸 样品中若含有蛋白质或苯酚等杂质，此比值则显著降低。 实验三实验三 感受态细胞的制备及转化感受态细胞的制备及转化 一、实验原理一、实验原理 感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的 DNA 分 子。转化是将外源 DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状

32、的一种手段。转化的基本原理是细 胞处于 0，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基钙磷酸 混合物粘附于细胞表面，经 42短时间热冲击处理，促使细胞吸收 DNA 复合物，在选择性培养基平板 上培养，可选出所需的转化子。 二、实验目的二、实验目的 1学习和理解影响细胞感受态的因素，掌握感受态细胞的制备方法。 2掌握质粒的转化方法。把体外 DNA 引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出转化子。 三、实验材料和用具三、实验材料和用具 材料：自制的质粒 DNA、大肠杆菌(E.coli)菌种(DH5 菌株)。 试剂： LB 琼脂平板 (无抗生素)

33、、 LB 琼脂平板 (含 50g/L 氨苄青霉素)、 LB 液体培养基 5mL(无抗生素)、 LB 液体培养基 100mL(无抗生素)、 LB 液体培养基 5mL(含 50g/L 氨苄青霉素)、 0.1mol/LCaCl2溶液(灭菌备用)。 仪器： 恒温培养箱、恒温摇床、接种环、涂布器、冷冻离心机、离心管、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅。 四、操作步骤四、操作步骤 (一)大肠杆菌感受态细胞的制备 1从新活化的E.coliDH5 菌平板上挑取一单菌落，接种于 5mL 液体培养基中，37振荡培养过夜， 直至对数生长期。将该菌悬液以 1：50 接种于 50mL LB 液体培养基中，37快速振荡培养 34

34、h。 2取 5mL 培养液放入离心管中，在冰上放置 10min，于 45000rpm 离心 10min。 3可用加样器将残余液体尽量去净，用 1mL 预冷的 0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置 1530min。 4于 4，5000rpm 离心 10min。 5弃上清，加入 200L 预冷的 0.1mol/LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻，即制成了感受态 细胞悬液。 6制好的感受态细胞可在冰上放置，24h 内直接用于转化实验，也可加入占总体积 95左右高压灭菌 过的甘油，混匀后分装于 Ep 管中，-70条件下可保存半年至一年。 (二)细胞转化 取 200L 摇匀后的

35、感受态细胞悬液，进行下一步的转化，转化如下（单位：L）： 样品组即为我们的转化组：100L 感受态细胞2L 质粒 DNA 对照 1 为受体菌对照组：100L 感受态细胞2L 无菌水 对照 2 为质粒 DNA 对照组：100L0.1mol/LCaCl22L 质粒 DNA 将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置 30min 后，于 42水浴中保温 90s，然后迅速在冰上冷却 35min。上述各管中分别加入 400L LB 液体培养基，使总体积为 500L，该溶液称为转化反应原液， 摇匀后于 37振荡培养 30min，使受体细胞恢复正常生长状态，并使转化体产生抗药性。 (三)平板培养 取各样品培养液 100

36、L 分别接种于含氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的 LB 平板培养基上（分别记 为 Amp和 Amp） ，涂匀。37培养 24h，待菌落生长良好且未相互重叠时停止培养。 (四)检出转化体 五、注意事项五、注意事项 编号质粒感受态细胞无菌水 0.1mol/LCaCl2 样品 2100/ 对照 1 /1002/ 对照 2 2/100 不含抗生素培养基-含抗生素培养基+结果分析 受体菌对照组 A有大量菌落长出无菌落长出本实验未产生抗药性菌株 质粒对照组 B无菌落长出无菌落长出质粒 DNA 不含杂菌 转化实验组 C有大量菌落长出有菌落长出质粒进入受体菌中产生抗药 性 1这一个实验中的所有操作均要为无菌操作，

37、在超净工作台内进行。 2细胞转化中，42水浴 90s 要准确操作。 3制备感受态细胞过程中，需要在冰上放置的一定不要在室温中放置。 思考题思考题 1感受态细胞制备好后，为什么在转化前还要在冰上放置？ 答：细菌处于 0，CaCl2 的低渗溶液中，菌细胞会膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面（因为 DNase 会消化外源 DNA，如形成抗 DNase 的物质有 利外源 DNA 的生存） ，从低温突然提高到 42短时间热刺激，应激反应下可产生大量 cAMP，而 cAMP 可 改变细胞膜通透性，促使细胞吸收 DNA 复合物，从而大大提高转化率。 2

38、思考转化后平板培养应有的结果、分析自己培养的情况。 答：实验涉及两种菌体，一为不含氨苄抗性基因的细胞，二为含有氨苄抗性基因的细胞。细胞 一因为不含苄抗性基因，所以会被氨苄杀死或抑制生长，所以这种细胞只能在不含有氨苄的培养基上 生长。细胞二为含有氨苄抗性基因的细胞，能对氨苄产生抗性，故而这种细胞既能在不含有氨苄的培 养基上生长，又能在含有氨苄的培养基上生长。 A 组中只有菌体和 CaCL2而无抗性基因，所以只有在不含氨苄的培养基上才能看到菌落，而在含 有氨苄的培养基上不可能有菌落，否则为培养基染菌。 B 组中只有 CaCL2和含有抗性基因的质粒而没有细胞，所以不管在那种培养基上都不应该长出菌 落

39、，否则即为染菌。 C 组中含有 CaCL2、含有抗性基因的质粒和不含氨苄抗性基因的大肠杆菌细胞。在 CaCL2的作用下， 细菌细胞壁结构发生变化，导致含有抗性基因的质粒进入细胞，此过程即为转化。此时的细胞即为细 胞二，所以不管是在含有氨苄的培养基上还是在不含有氨苄的培养基上都能观察到菌落。且在含有氨 苄的培养基上观察到的菌落数应该比在不含有氨苄的培养基上都能观察到菌落数少，因为转化这个过 程的效率不是 100%，没有转入抗性基因的细胞就不能在含有氨苄的培养基上生长。 观察平板，结果与理论结果完全一致。 附录： 1. pH8.0 G.E.T.缓冲液 (灭菌后使用) ： 葡萄糖 0.991g ED

40、TA-Na2 0.372g Tris-HCl 0.303g H2O 100mL 2. 5mol/L KAc：49.08g KAc 溶于 100mL H2O。 3. PH4.8 乙酸钾溶液：取 60mL 5mol/L KAc,11.5mL 冰醋酸，28.5mL H2O 即可。 4. 0.2mol/LTris-Cl：2.422g 溶于 100mL H2O。 5. 0.2mol/LHCl：取 1.724mL 浓 HCl 稀释到 100mL。 6. pH8.0 0.1mol/L Tris-HCl：取 0.2mol/LTris-Cl 50mL 加入 29.2mL 0.2mol/LHCl，补 H2O 至

41、100mL 即可。 7pH8.0 10mmol/LEDTA-Na2：3.722g EDTA-Na2溶于一定量的 H2O 中，用固体 NaOH 调节其 pH 值，最 后定容至 100mL。 8pH8.0TE：取 10mL pH8.0 0.1mol/L Tris-HCl，10mL pH8.0 10mmol/L EDTA -Na2，最后定容至 100mL，调节 pH 至 8.0。含 RNA 酶（RNaseA）20ug/mL。 9pH7.6 0.1mol/L Tris-HCl：取 0.2mol/LTris-Cl 50mL 加入 38.5mL 0.2mol/L HCl，补 H2O 至 100mL 即可。

42、用于饱和酚/仿混合物。 10酚/仿溶液（按如下体积和顺序加入试剂） 饱和酚：重蒸酚 12.5mL 三氯甲烷 12mL 异戊醇 0.5mL 用 pH7.6 0.1mol/L Tris-Cl 平衡 23 次，在饱和酚/仿上，加入等体积的 pH7.6 0.01mol/L Tris-Cl 保护，棕色瓶保存，4存放。 115TBE： 称取 Tris-Cl 21.8g，硼酸 11.0g 和 EDTA-Na2 1.4g 用蒸馏水溶解，定容至 400mL。临用 时稀释为 0 .5TBE。 120.1 mol/LCaCl2：5.5g CaCl2溶于 500mL H2O。灭菌后备用。 13无菌水。 实验四实验四

43、PCRPCR 扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测 【实验目的实验目的】 掌握 PCR 扩增技术的基本原理 掌握 PCR 的常规操作 熟悉 PCR 反应体系中六种主要成分的作用 了解 PCR 技术的应用 掌握琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物的方法 熟悉 DNA 在电泳过程中迁移率的决定因素 【实验原理实验原理】 1.1. PCRPCR 基本原理基本原理 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称 PCR，是一种分子生物学技 术，用于在体外快速扩增 DNA，类似 DNA 的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温 度的调节，使双链 DNA 变性为

44、单链 DNA、单链 DNA 能与引物复性（退火）成为引物- DNA 单链复合物、以及在 dNTPs 存在下 DNA 聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链 DNA（引物的延伸） ；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个 PCR 循环；一般通过 20-30 个循环之后，就可获得大量（106倍）的要扩增的 DNA 片段。 PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端 互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 93左右一定时间后，使模板 DNA 双链或 经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离

45、，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作 准备； 模板 DNA 与引物的退火(复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55 左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反 应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环“变性退火延伸”三个过程就可获得更多的“半保留复制链” ，而 且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24 分钟，23 小时就能 将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 2.2. PCRPCR 反

46、应体系反应体系 标准的标准的 PCRPCR 反应体系反应体系 本实验所用的本实验所用的 PCRPCR 反应体系（反应体系（5050 ll） 10扩增缓冲液 10lddH2O38.75 ul 4 种 dNTP 混合物 200l 10PCR Buffer (含 Mg2+) 5 ul 引物10100l 10mM dNTPs S 1.25 ul 模板 DNA0.12g引物 1.25 +1.2 5 ul Taq DNA 聚合酶 2.5 l 模板 (质粒 DNA) 2 ul Mg2+1.5mmol/L Taq 酶 0.5 ul 加双或三蒸水 100 l 3 3、 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电

47、泳是分离、纯化、鉴定 DNA 片断的典型方法，其特点为简便、快速。DNA 片断琼脂糖 凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA 分子在高于其等电点的 pH 溶液中带负电荷，在电 场中向正极移动。DNA 分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分 子大小及构想有关。对于线形 DNA 分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加 入少量溴化乙锭（有毒！） ，其分子可插入 DNA 的碱基之间，形成一种光络合物，在 254365nm 波长紫 外光照射下，呈现桔红色的荧光，因此可对分离的 DNA 进行检测。电泳时以溴酚蓝及二甲苯氰（蓝） 作为双色电泳指示

48、剂。其目的有：增大样品密度，确保 DNA 均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色， 了解样品泳动情况，使操作更为便利；以 0.5TBE 做电泳液时溴酚蓝的泳动率约与长 700bp 的双链 DNA 相同，二甲苯氰（蓝）则与 2Kbp 的 DNA 相同。 【实验仪器、材料和试剂实验仪器、材料和试剂】 1、仪器：微量移液器，枪头(10L,200L)枪头盒，离心管(200L)，PCR 仪，电泳仪，电泳槽， 凝胶成像系统。 2、材料：模板 DNA 引物 3、试剂：dNTP TaqDNA 聚合酶 【实验步骤实验步骤】 1.1. 按照以下顺序，依次添加入按照以下顺序，依次添加入 PCRPCR 管内。管内。 ddHddH2 2O O 38.7538.75 ulul 10Buffer10Buffer 5 5 ulul dNTPdNTP 1.251.25 ulul 引物引物 1.251.25 +1.25+1.25 ulul 模板模板 2 2 ulul TaqTaq 酶酶 0.50.5 ulul 2.2. 将配制好的将配制好的 PCRPCR 体系充分混匀后，离心。体系充分混匀后，离心。 3.3. 盖紧盖紧 PCRPCR 管的盖子，插入管的盖子，插入 PCRPCR 仪的孔内。仪的孔内