第3章氨基酸和蛋白质

1、第3章 氨基酸和蛋白质一、教学大纲基本要求氨基酸的结构特点和构型、物理和化学性质以及氨基酸的分离和分析。肽和肽键的结构和性质以及生物学功能。蛋白质的结构层次，一级结构测定，一级结构与生物功能。蛋白质二级结构，肽链的构象，二级结构的基本类型，超二级结构与结构域和纤维状蛋白质。一级结构决定高级结构，维持三级结构的作用力，球状蛋白质的结构域和三级结构的功能，蛋白质四级结构与功能与功能，免疫球蛋白的结构与功能。蛋白质两性性质及应用，胶体性质与蛋白质沉淀，蛋白质的变性，分离纯化蛋白质的主要方法。二、本章知识要点（一）氨基酸1蛋白质的组成蛋白质是由20种基本氨基酸组成的。用酸、碱或蛋白酶可以分别将蛋白质水

2、解，生成游离的氨基酸。2氨基酸的结构与分类常见的蛋白质氨基酸（基本氨基酸）有20种，是构成蛋白质的结构单元。20种基本氨基酸中，有19种氨基酸是a氨基酸，即与羧基相邻的a碳原子上都有一个氨基。脯氨酸是亚氨基酸。各种氨基酸的区别在于侧链R基的不同，根据R基团结构的不同，可以将20种氨基酸分为脂肪族、芳香族和杂环族3类。按照R基团的极性性质，又可以将20种氨基酸分为4类：非极性R基氨基酸，不带电荷的极性R基氨基酸，带正电荷的R基氨基酸，带负电荷的R基氨基酸。氨基酸侧链R基的性质决定了蛋白质的结构特点、性质和功能。不常见的蛋白质氨基酸有10多种，在蛋白质中由基本氨基酸经过修饰生成的。3氨基酸的两性性

3、质在结晶状态或在水溶液中，氨基酸主要以两性离子形式存在。a羧基pK1在2.0左右，当pH3.5，a羧基主要以COO-形式存在。a氨基pK2在9.4左右，当pH3.5，a羧基主要以COO-形式存在。a氨基pK2在9.4左右，当pH8.0时，a氨基主要以aNH+3形式存在。氨基酸在pH3.58.0时，带有相反电荷，是两性离子。在溶液中，氨基酸带有的电荷性质和电荷量随溶液pH值变化而变化。甘氨酸溶点232，比相应的乙酸（16.5）和乙胺（80.5）都高，可推测氨基酸在晶体状态是以两性离子形式存在的。6氨基酸的化学反应DNSCL（丹磺酰氯）反应：在弱碱性溶液中，氨基酸的氨基可以与丹磺酰氯（5二甲基氨基

4、萘1磺酰氯）发生酰基化反应，生成DNS氨基酸。此反应可以标记多肽链N末端氨基酸，用于测定多肽和蛋白质的N末端氨基酸。Sanger反应：在弱碱性溶液中，氨基酸的氨基与2，4二硝基氟苯(DNFB或FDNB)发生亲核芳香取代反应，生成二硝基苯基氨基酸。此反应可以用来分析多肽的N末端氨基酸。Edman反应：在弱碱性条件下，a氨基酸与苯异硫氰酸酯（PITC）反应，生成苯氨基硫甲酰衍生物（PTC氨基酸）。PTC氨基酸可以环化，生成苯乙内酰硫脲衍生物（PTH氨基酸），用层析法可以分离鉴定PTH氨基酸。用此方法可以分析多肽链N末端的氨基酸序列。茚三酮反应：在弱酸性条件下，a氨基酸与茚三酮共热，发生氨基氧化脱氨

5、和脱羧反应，生成紫色化合物，最大吸收波长max是570nm。脯氨酸与茚三酮反应，生成亮黄色化合物，最大吸收波长max是440nm。 此反应可以用于氨基酸含量的分析。氨基与酰化试剂反应 酰化试剂有苄氧酰氯、叔丁氧甲酰氯、苯二甲酸酐、对甲苯磺酰氯，以及5二甲基氨基萘1磺酰氯（丹磺酰氯DNS-Cl）。氨基与烷基化试剂反应 羧基中的氮是一个亲核中心，能发生亲核取代反应。生成西佛碱的反应（Schiff） 氨基酸的氨基与醛类反应，生成西佛碱，西佛碱是很多酶促反应中的中间产物，例如转氨基反应的中间产物。含硫氨基酸的烷基化反应 硫原子也是亲核中心，可发生亲核取代反应。生物体内，重要的甲基化剂是S腺苷甲硫氨酸（

6、SAM），是由Met与ATP作用得到的S烷基化产物。在酶催化下，SAM可以使多种生物分子的氨基甲基化，如磷脂酰胆碱的生物合成。羧基参加的反应 羧基与碱反应生成盐，与醇反应生成酯。羧基与二氯亚砜或五氯化磷反应生成酰氯，使羧基活化，可以用于多肽的人工合成。7氨基酸的光学性质氨基酸的a碳是一个不对称碳（甘氨除外）原子，氨基酸有D型和L型两种构型。蛋白质中的氨基酸都是L型，有些抗生素或微生物的细胞壁中有D型氨基酸。外消旋作用：混合等摩尔的D型和L型氨基酸，可以得到无旋光性的DL消旋物。内消旋作用：一个D型半胱氨酸和一个L型半胱氨酸，氧化生成内消旋胱氨酸。色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸可以吸收紫外光。蛋白质分

7、子在280nm有最大紫外光吸收，是因为蛋白质分子中含有这3种氨基酸残基。8氨基酸的分离和分析用纸层析、薄层层析、电泳、阳离子交换层析等方法可以分离氨基酸混合物。阳离子交换层析法：用含Na的缓冲液将阳离子交换树脂处理成钠盐，且pH值在2左右。将游离氨基酸的混合溶液（pH23）加入柱中，此时氨基酸都以阳离子形式存在，与树脂上的钠离子交换，被固定在树脂上。逐步提高洗脱液的pH值，减小氨基酸带有的正电荷量；同时逐步提高洗脱液的盐浓度，减小氨基酸与树脂的作用力，可以将固定在树脂上的氨基酸以不同的速度洗脱下来。被分离的氨基酸与茚三酮发生显色反应，根据衍生物对光吸收的强弱，可以定量分析各种氨基酸。氨基酸与离

8、子交换树脂的作用力主要有：静电吸引力和氨基酸侧链与树脂基质(聚苯乙烯)的疏水作用力。静电吸引力的大小直接与氨基酸的等电点有关，静电吸引力的大小顺序是：碱性氨基酸中性氨基酸酸性氨基酸。在等电点比较接近的氨基酸中，R侧链残基的疏水性越高，与树脂基质作用力越大，在层析柱中的停留时间（保留时间）越长。 （二）肽1肽和肽键的结构肽是由一个氨基酸的a羧基与另一个氨基酸的a氨基脱水缩合而成的化合物，氨基酸间脱水后生成的共价键称肽键（酰氨键），其中的氨基酸单位称氨基酸残基。由两个氨基酸缩合而成的肽称为2肽，少于10个氨基酸残基的肽称为寡肽，多于10个氨基酸残基的肽称为多肽。肽链上的各个侧链由不同的氨基酸侧链构

9、成。肽键的结构特点：酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间的共振作用，稳定性高。肽键亚氨基在pH014内不解离，个原子几乎处在同一平面内。2肽的化学性质肽的羧基、氨基和侧链R基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。 含有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，可用于定量分析。肽与双缩脲反应生成紫色或蓝紫色化合物，这是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。 3.生物活性肽生物体内有很多具有生物活性的多肽和寡肽，称活性肽。活性肽在生物的生长、发育、细胞分化、大脑功能、免疫、生殖、衰老、病变等过程中起重要作用。活性肽是细胞内部、细胞间、器官间信息传递的主要化学信使，很多激素、抗生素都属于肽类或肽衍生

10、物。（三）蛋白质一级结构1蛋白质的结构层次 一级结构：蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序（含二硫键）。二级结构：多肽链中各个肽段借助氢键形成有规则的构象。主要有螺旋、折叠和转角。超二级结构：由两个或两个以上二级结构单元相互聚集，形成的有规则的二级结构的组合体。例如、等结构。结构域：多肽链在二级结构或超二级结构基础上形成三级结构的局部折叠区。结构域是蛋白质的独立折叠单位，一般由100200个氨基酸残基构成。三级结构：多肽链借助各种非共价键的作用力，通过弯曲、折叠，形成具有一定走向的紧密球状构象。球状构象的比表面积最低，使蛋白质与周围环境的相互作用力最小。四级结构：寡聚蛋白中各亚基之间在空间上的相互

11、关系和结合方式。2蛋白质一级结构测定蛋白质测序的基本策略：用两种以上不同的裂解方法裂解蛋白质，产生两套切点不同的肽段。分离、纯化每一个肽段，分别测定每一个肽段的氨基酸序列，用重叠法拼接出一条完整的肽链。 主要步骤：A.根据蛋白质末端分析结果和相对分子质量，确定蛋白质分子中多肽链的数目。B.如果蛋白质是寡聚蛋白，用变性剂（如8.0mol/L尿素）拆分蛋白质亚基。C.断开多肽链内的二硫键。D.分析每一条多肽链的氨基酸组成，计算多肽链中氨基酸残基的数目。E.分析N末端和C末端氨基酸，确定氨基酸测序的两个端点。F.选用两种不同的裂解方法将一条多肽链裂解成两套重叠的肽段，分离纯化每一个肽段，分别用Edm

12、an降解法测定每一个肽段的氨基酸序列。G.用片断重叠法拼接出一条完整的肽链。H.确定二硫键的位置。I.确定肽链中的天冬酰胺和谷氨酰胺3同源蛋白质在不同生物体内具有相同或相似功能的蛋白质。例如，血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能。同源蛋白质的特点：（1）多肽链长度相近，氨基酸序列相似。（2）同源蛋白质的氨基酸序列中，有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基。不变残基高度保守，是必需的。如果不变残基发生变化，会影响蛋白质的功能。（3）除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基。可变残基中，个别氨基酸的变化不一定影响蛋白质的功能。（四）蛋白质的二级机

13、构和纤维状蛋白质1多肽主链的折叠多肽链的共价主链上所有的碳原子都参与形成单键，因此一个多肽主链可能有无限多种构象。生物体内蛋白质的多肽链只有一种或很少几种构象，这种构象称蛋白质的天然构象。天然构象的蛋白质具有生物活性，且相当稳定。在生物体内天然构象的蛋白质主链上的单键不能自由旋转。肽链的二面角，肽链的所有可能构象都能用和这两个构象角来描述，称二面角。多肽链折叠的空间限制，和同时为0的构象实际不存在，因为两个相邻平面上的酰胺基氢原子和羰基氧原子的接触距离比其范德华半经之和小，空间位阻。二面角（、）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。2拉氏构象图实线封闭区域

14、内任何二面角确定的构象都是允许的，且构象稳定。虚线封闭区域是最大允许区，立体化学允许，但构象不够稳定。虚线外区域是不允许区，该区域内任何二面角确定的肽链构象，都是不允许的，此构象中非键合原子间距离小于最小允许距离，排斥力很大，构象极不稳定。3蛋白质的二级结构驱使蛋白质折叠的主要动力有:a.暴露在溶剂中的疏水基团降低至最少程度。B.保持处于伸展状态的多肽链和周围水分子间形成的氢键相互作用的有利能量状态。螺旋 螺旋是蛋白质中常见的一种二级结构，肽链主链绕中心轴盘绕成螺旋状，相邻螺圈之间形成链内氢键。在3.613螺旋中，二面角=57，=48，肽键上NH氢与它后面（N端）第四个残基上的C=O氧间形成氢

15、键，螺距是0.54nm，每一圈含有3.6个氨基酸残基，每个残基沿着螺旋的长轴上升0.15nm，氨基酸残基的侧链向外伸展。螺旋的种类有2.27螺旋（n=1），310 螺旋（n=2），3.613螺旋（n=3）和4.316螺旋（n=4）。氨基酸侧链对螺旋稳定性的影响如果多肽链上连续出现带同种电荷的氨基酸残基，（例如Lys，或Asp，或Glu），则由于静电排斥，不能形成链内氢键，从而不能形成稳定的螺旋。例如多聚赖氨酸和多聚谷氨酸。而当这些残基分散存在时，不影响螺旋稳定。甘氨酸的角和角可取范围较大，在肽链中连续出现时，使形成螺旋所需的二面角的可能性很小，不易形成螺旋。丝心蛋白含50%Gly，不形成螺旋。

16、肽链中的R基较大（如Ile）时，不易形成螺旋。脯氨酸和羟脯氨酸终止螺旋。R基较小，且不带电荷的氨基酸利于a-螺旋的形成。蛋白质中的螺旋几乎都是右手螺旋，但也有例外，在嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左手螺旋，由AspAsnGlyGly（226229）组成，二面角是+64和+42。.折叠 两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的NH氢和C=O氧之间形成氢键，这样的多肽构象就是折叠。折叠中所有的肽链都参与链间氢键的形成，侧链R基交替地分布在片层平面的两侧。折叠有平行式和反平行式2种。平行式：所有参与折叠的肽链的N末端在同一方向，二面角=119，=+113。反平行式：肽链的极性顺倒，

17、N末端间隔相同，二面角=139，=+135。在纤维状蛋白质中折叠主要是反平行式，而在球状蛋白质中反平行和平行两种方式都存在。在纤维状蛋白质的折叠中，氢键主要是在肽链之间形式；而在球状蛋白质中，折叠既可在不同肽链间形成，也可在同一肽链的不同肽段间形成。从能量角度看，反平行折叠比平行的更稳定，前者的氢键NH-O几乎在一条直线上，氢键最强。.转角 转角是指蛋白质分子中出现的180回折，有时称之为发夹结构。由第一个氨基酸残基的C=O与第四个氨基酸残基的NH间形成氢键。目前发现的转角多数在球状蛋白质分子表面，转角在球状蛋白质中含量十分丰富，约占全部残基的1/4。转角的特征：由多肽链上4个连续的氨基酸残基

18、组成。主链骨架以180返回折叠。第一个氨基酸残基的C=O与第四个氨基酸残基的NH形成氢键。C1与C4之间距离小于0.7nm。多数由亲水氨基酸残基组成。.无规卷曲 没有规律的多肽链主链骨架构象。二面角、存在于拉氏图上所有允许区域，它在球状蛋白中含量较高，对外界物理、化学因素敏感，与蛋白质的生物活性有关。螺旋、转角和折叠的二面角、在拉氏构象图上有固定区域，而无规卷曲的、二面角可存在于所有允许区域内。.超二级结构 两个或两个以上二级结构单元相互聚集，形成的有规则的二级结构的组合体。超二级结构有aa、a和三种基本的组合形式。.结构域和功能域 多肽链在二级结构或超二级结构基础上形成三级结构的局部折叠区。

19、结构域是独立的紧密球状实体，是蛋白质的独立折叠单位，一般由100200个氨基酸残基构成。功能域是蛋白质分子中能独立存在的功能单位。功能域可以是一个结构域，也可以由两个或两个以上结构域组成。4.纤维状蛋白质纤维状蛋白质是动物体的基本支架和外保护成分，占脊椎动物体内蛋白质总量的一半以上。分子是有规则的线形结构，外形是纤维状或棒状。纤维状蛋白质分为不溶性和可溶性两类，不溶性的主要有角蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白，可溶性的有肌球蛋白和血纤维蛋白。（五）蛋白质三级结构、四级结构与功能1蛋白质的三、四级结构蛋白质的三级结构 在二级结构（a螺旋、折叠、转角和无规卷曲）的基础上，多肽链借助各种非共价键的作用，通过

20、弯曲、折叠，形成具有一定走向的紧密球状构象。球状构象的比表面积最小，使得蛋白质与周围环境的相互作用力最小。球状蛋白质三维结构特征 球状蛋白质都有各自独特的三维结构，但是它们都具有以下共同的结构特征。球状蛋白质含有二种或二种以上二级结构单元（a螺旋、折叠、转角和无规卷曲），具有明显的折叠层次，是紧密的球状或椭球状实体，疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面，分子表面有一个裂隙，通常是底物或效应物的结合部位。.膜蛋白的结构 膜蛋白可以分为膜周边蛋白和膜内在蛋白。膜周边蛋白是可溶性球状蛋白质，分布在膜表面，通过非共价键与膜结合。膜内在蛋白通过疏水肽段锚定在膜上，膜内在蛋白主要有三种：单个跨膜

21、肽段的膜蛋白、7个跨膜肽段的膜蛋白和桶型膜蛋白。还有一些蛋白质能与膜上的脂质形成共价键，锚定在膜上，形成膜蛋白。.蛋白质的折叠 蛋白质折叠时，通过积累选择形成自由能最低的构象。球状蛋白质的折叠步骤：先快速形成局部二级结构（a螺旋和折叠）；再形成初始的结构域，并由结构域形成熔球态；最后调整结构域的构象，形成完整的三级结构。在生物体内，蛋白质的折叠需要分子伴侣的参与。.蛋白质三级结构的稳定性 稳定蛋白质三级结构的作用力主要是非共价键作用力，其中包括氢键、范德华力、疏水作用和盐键，此外还有二硫键。.蛋白质的四级结构 蛋白质的四级结构涉及亚基的种类和数目，以及各个亚基在整个蛋白质分子中的空间排布，亚基

22、间的接触位点（结构互补）和作用力（非共价作用力）。四级结构在结构和功能上的优点： 可以增强蛋白质结构的稳定性。 可以提高遗传经济性和效率。 使得酶分子的不同催化亚基聚积在一起，提高催化效率。 使得蛋白质具有协同效应和别构效应。2. 球状蛋白质的结构与功能肌红蛋白在哺乳动物细胞中存储和分配的氧 肌红蛋白由一条多肽链组成，分子中多肽主链由8段直的a螺旋组成，最长的a螺旋有23个氨基酸残基，最短的a螺旋有7个氨基酸残基，75%的氨基酸残基处在a螺旋区内。肌红蛋白多肽链绕曲成球状分子，疏水氨基酸残基几乎全部在分子内部，例如Val、Leu、Met、Phe等，亲水氨基酸残基几乎全部在球状分子的外表面。4个

23、Pro残基各自处在1个拐弯处，Ser、Thr、Asn和Ile分别处在另外4拐弯处。血红素中，卟啉环中心的Fe2+有六个配位键，其中4个与平面卟啉分子的N结合，另外两个与卟啉平面垂直，1个与93位His(F8)的咪唑基的N结合，另一个处于开放状态，可以结合O2。肌红蛋白为血红素提供了一个疏水环境，避免Fe2+被氧化而失去氧结合能力。血红蛋白的结构与功能 血红蛋白在血液中结合并转运氧。血红蛋白分子接近于球体，4个亚基分别在四面体的四个角上，每个亚基上有一个血红素辅基。HbA是成人体内主要的血红蛋白，具有a2 b2的亚基结构。血红蛋白与氧结合具有别构效应，氧合曲线是S形曲线。氧与第一个血红素的结合后

24、，有助于后续的氧与血红蛋白分子中其余的三个血红素结合。在肌肉组织中，H+和CO2促进血红蛋白释放O2；在肺泡毛细管中，O2促进血红蛋白释放H+和CO2。2、3二磷酸甘油酸（BPG）是血红蛋白的别构效应物，它能与去氧血红蛋白结合，降低血红蛋白对氧的亲和力。镰刀状细胞贫血的分子机理 镰刀状细胞贫血是由于基因突变，引起血红蛋白分子中氨基酸残基被替换所造成的。人的血红蛋白分子的四条肽链中，只有两个Glu分子变化成Va1分子，就能发生镰刀状细胞贫血病。正常人血红蛋白，6是Glu，镰刀状细胞贫血的患者的血红蛋白6是Val。在生理条件下，Va1不带电荷，疏水，Glu带负电荷，亲水。3免疫球蛋白的结构特点和功

25、能抗原与抗体 抗原是指进入异体机体后，能致敏淋巴细胞产生特异抗体，并能与抗体发生特异结合的物质，主要有蛋白质、核酸以及其它高分子化合物。抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白，它是能与相应抗原特异性结合并产生免疫反应的球状蛋白质，称免疫球蛋白。抗体具有高度特异性和多样性，人类能够产生超过108种的抗体。. 免疫球蛋白的结构特点 IgG分子由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，四条肽链间有二硫键连接。重链的分子量为53000左右，轻链的分子量为22000左右。重链和轻链各分两个区域，重链N-端1/4为可变区，C-端3/4为恒定区，轻链N-端1/2为可变区，C-端1/2为恒定区

26、。重链的可变区和轻链的可变区共同组成一个抗原结合部位。. 抗体抗原反应 以IgG为例，一个IgG分子含有2个抗原结合部位，它们位于Y形结构的2个臂的顶端。如果抗原分子含有2个抗原决定簇，抗体可以形成抗原抗体的交联晶格，产生沉淀反应。抗原抗体反应的条件：抗原决定簇与抗体结合部位构象互补，抗原与抗体有对应的化学基团，通过作用力（离子键、氢键）使二者结合。抗原抗体反应可以广泛用于生物化学分析，例如免疫扩散，免疫电泳，酶联免疫分析和Western印迹。（六）蛋白质的性质及其应用1蛋白质的两性性质蛋白质分子中，侧链上各种可解离基团以及末端的a氨基和a羧基的解离性质，决定了蛋白质所带电荷的性质和数量。在溶

27、液中，当某种蛋白质所带的净电荷为零时，对应的pH值称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸的残基数与碱性氨基酸的残基数之比有关系。酸性氨基酸残基的含量越高，等电点越低；碱性氨基酸残基的含量越高，等电点越高。在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度、粘度均为最小值。2蛋白质的变性与复性某些物理或化学因素（高温、高压、紫外线和表面张力、强酸、强碱、有机溶剂、脲和胍）能破坏蛋白质分子的次级键，使得蛋白质的天然构象解体，但一级结构不变。蛋白质变性的后果是生物活性丧失，侧链基团外露，物理、化学性质改变，生物化学性质改变。蛋白质的复性是指当变性因素除去以后，变性的蛋白质又可以重新回复到原来的天

28、然构象。蛋白质的复性实验证明，蛋白质的一级结构决定蛋白质的高级结构。3凝胶过滤法测定蛋白质相对分子量的原理不同大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶颗粒的网状结构中，被排阻在颗粒之外，通过颗粒之间的间隙快速流出层析柱。比凝胶孔径小的分子能不同程度地进入凝胶颗粒的网状结构中，因此不同大小的蛋白质分子在层析柱中移动的路径不同，分子量大的蛋白质先流出柱子，分子量小的蛋白质后流出柱子。4SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量的原理SDS是强变性剂，能破坏蛋白质分子中的氢键和疏水作用力，巯基乙醇能打开二硫键。在有SDS和巯基乙醇存在下，单体蛋白或亚基的多肽链展开。SDS与蛋

29、白质结合，使得多肽链带上大量的相同密度的负电荷，掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差异，使得不同蛋白质的电荷/质量比相同。此外在SDS的作用下，SDS蛋白质复合物在水溶液中呈棒状，直径约为1.8nm，长度与蛋白质的相对分子量成正比。分子量小的蛋白质在凝胶中迁移速度快，分子量大的蛋白质在凝胶中迁移速度慢。5蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化主要涉及两个方面：蛋白质与非蛋白质化合物的分离。不同种类蛋白质之间分离。可以利用蛋白质与非蛋白质之间物理、化学性质的差异，以及蛋白质之间物理、化学性质的差异来分离蛋白质。蛋白质溶解度的差异：不同的蛋白质在同一种溶剂中溶解度不同，同一种蛋白质在不同的溶剂中溶解度不同

30、。主要有PEG沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法和热变性法。蛋白质电荷性质的差异：不同蛋白质中含有的酸性氨基酸残基与碱性氨基酸残基的比例不同，它们的等电点不同，在一定的pH环境中带有的电荷性质和电荷量不同。因此可以用离子交换层析法和电泳法分离纯化蛋白质。电泳法主要有聚丙烯酰氨凝胶电泳、毛细管电泳、等电聚焦电泳和层析聚胶电泳。分子大小的差异：可以根据蛋白质分子大小的不同，选用凝胶过滤法、超滤法、透析法和离心法来分离纯化蛋白质。与配体亲和力的差异：根据不同的蛋白质能分别与相应的特异性配体非共价结合，利用亲和层析法可以分离纯化蛋白质。6蛋白质含量的测定测定总蛋白质含量的方法有：凯氏定氮法、双缩尿法

31、、Folin酚法和紫外吸收法。测定某一种特定蛋白质的含量，可以用生物学的方法。对于酶或激素蛋白，可以利用它们的酶活性或激素活性来测定。对于不具备酶活性或激素活性的蛋白质，可以利用抗体抗原反应来测定。7蛋白质纯度的鉴定鉴定蛋白质纯度的方法主要有电泳法、高效液相层析（HPLC）法、溶解度分析法、沉降法和N末端氨基酸分析法。电泳法主要有等电聚焦电泳，毛细管电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。如果是纯的均一的蛋白质，电泳法、高效液相层析法分析图谱上只出现一个条带或一个峰。三、重点、难点 重点：氨基酸的结构，氨基酸侧链的物理、化学性质与多肽和蛋白质的结构和功能的关系。氨基酸的两性性质，氨

32、基酸的化学性质与应用。蛋白质一级结构的测定，肽的结构与功能。蛋白质的二级结构，蛋白质的高级结构，生物体内蛋白质的功能，蛋白质的变性与复性，蛋白质的折叠。纤维蛋白质的结构特征与功能，球状蛋白质结构特征与功能。肌红蛋白与血红蛋白的结构特点和氧合曲线。免疫球蛋白的结构与功能，酶联免疫吸附分析法（ELISA）。蛋白质的分离纯化方法及纯度鉴定。难点：氨基酸的结构与蛋白质的结构和功能的关系，氨基酸滴定曲线，氨基酸的化学反应及其应用，蛋白质一级结构的测定，蛋白质的二级结构，球状蛋白质的结构与功能，寡聚蛋白的结构与功能，肌红蛋白与血红蛋白的氧合曲线，蛋白质的分离纯化方法。四、典型例题解析例题3-1：对蛋白质中

33、自然发生的氨基酸替换的研究结果如下，请解释下列现象。（1）丝氨酸的替换最不容易引起蛋白质功能的改变。（2）色氨酸的替换最容易引起蛋白质功能的改变。（3）LysArg和IleLeu这样的替换一般对蛋白质的功能基本没有影响。解:蛋白质分子中，氨基酸残基侧链基团的大小、电荷性质和极性的改变都可能引起蛋白质结构的变化，从而影响蛋白质的功能。（1）Ser具有一个中等大小的侧链，侧链是极性的，不带电荷。极性不带电荷的残基（Asn、Gln或Thr）或者极性带电荷的残基（Arg、Asp、Glu或Lys）有可能取代Ser，不会显著破坏蛋白质的构象。（2）Trp侧链的的疏水性最强，往往出现在球状分子的内部。在蛋白

34、质疏水核内，Phe苯环形成的范德华力的能力比Trp吲哚环的要小，会引起蛋白质的结构发生显著变化，影响蛋白质的功能。（3）Lys和Arg的侧链都带正电荷，且长度相近。Ile和Leu大小相似，且都疏水。这两种替代几乎不影响蛋白质的整体构象，因此不会影响蛋白质的功能。 例题3-2：（a）Tris是一个弱酸（Ka=8.310-9mol/L，它是生化实验中常用的缓冲剂。问在pH8.00时，Tris有其共轭酸（Tris-H+）的比值是多少？（b）若上述溶液中Tris的总浓度为100mmol/L，在加入5mmol/L(H+)后，溶液pH值是多少？若Tris的总浓度减少到20mmol/L，pH变化又是多少？

35、解：（a）因为pH=pKa+1g（Tris/Tris-H+） pKa=-1gKa=8.08 所以8.00=8.08+1g（Tris/Tris-H+） Tris/Tris-H+=0.83 (b)若Tris+Tris-H+=100mmol/L则根据（a）中结果可得： Tris=45mmol/L Tris-H+=55mmol/L当加入5mmol/LH+后，则Tris减少5mmol/L，而Tris-H+增加5mmol/L，即：Tris=4 0mmol/L Tris-H+=60mmol/L因此 pH=pKa+1g（Tris/Tris-H+） 8.08+1g（40/60）=7.9即加入5mmol/LH+可

36、使pH降低0.1单位。若Tris的总浓度为20mmol/L，则 Tris+Tris-H+=20mmol/L Tris/Tris-H+=0.83所以 Tris=9mmol/L Tris-H+=11mmol/L加入5mmol/LH+后，则Tris减少到4mmol/L，而Tris-H+增加到16mmol/L，pH=pKa+1g（Tris/Tris-H+） 8.08+1g4/16）=7.48即此时加入5 mmol/L可使pH降低0.52个单位。例题3-3：用阳离子交换层析分离下列每一对氨基酸，用pH7的缓冲溶液洗脱，哪一种氨基酸先从离子交换柱上流出，为什么？A. Lys与Met。B. Lys与Asp。

37、C. Glu与Met。D. Gly与Leu。E. Ser与Ala。解：影响氨基酸流出顺序的主要因素是：（1）pH7时氨基酸的电荷性质和电荷量，通常等电点低的氨基酸带有负电荷，不与阳离子交换树脂结合，因此会先流出，反之，带正电荷，后流出。（2）电荷量相同或相近时，侧链R基团疏水性强的氨基酸与树脂基质作用力大，因此会后流出。A. Met先流出。Lys的等电点pI=9.74，Met的等电点pI=5.75，在pH7时Lys带有一个的正电荷，与阳离子交换树脂结合牢固。而Met带负电荷，不能与阳离子交换树脂结合，因此Met先流出。B. Asp先流出（Asp的pI=2.97）。 C. Glu先流出（Glu的

38、pI=3.22）。D. Gly先流出（Gly的pI=5.97，Leu的pI=5.98）。这两种氨基酸的等电点几乎相同，这时要考虑它们的侧链基团的疏水性。Gly的侧链基团的疏水性比Leu的小，与树脂基质作用力小，因此Gly先流出。E. Ser先流出。Ser的等电点是pI=5.68，Ala的等电点是pI=6.02，而且Ala侧链的疏水性比Ser的大。例题3-4：结合肌红蛋白和血红蛋白的氧合曲线，简述动物体内的氧从肺中转运到肌肉中的过程。肺泡中的p（O2）为100torr，肌肉的毛细管中p（O2）为20 torr，P50=26torr。血红蛋白在肺泡中的Y值是0.97，在肌肉的毛细管中的Y值是0.2

39、5。肌红蛋白的P50=2torr。解：肌红蛋白是单亚基的氧结合蛋白，它的氧合曲线是双曲线。血红蛋白是含有4个亚基的氧结合蛋白，亚基间存在协同效应，它的氧合曲线是S形曲线。血红蛋白在肺泡中的氧分数饱和度Y是0.97，因此肺泡中的血红蛋白能大量地结合氧，并且将氧运到肌肉组织中。在肌肉毛细血管中，血红蛋白的氧分数饱和度Y是0.25，大量释放氧，氧的释放量Y是0.72。肌肉毛细血管中的肌红蛋白的P50=2 torr，可以高度结合血红蛋白释放的氧。例题3-5：分离纯化蛋白质的一般原则是什么?解：在分离纯化某一个特定蛋白质时，通常要求在尽量保持蛋白质的天然构象和活性的同时，提高蛋白质的纯度、均一性和回收率

40、，一般可以分为以下几步。（1）前处理 用各种方法将细胞破碎，使蛋白质从组织或细胞中释放到提取液中，用过滤或离心法除去细胞碎片。动物组织和细胞可以用电动捣碎机、匀浆器或超声波破碎机处理。植物组织和细胞可以用石英砂与提取液一起研磨，或用纤维素酶处理。细菌细的胞壁可以用超声波破碎机处理，与石英砂研磨或用溶菌酶处理。（2）粗分级分离 前处理得到的蛋白质溶液中含有大量的杂蛋白以及少量的核酸和多糖，可以选用适当的方法，去除杂蛋白。一般可以采用盐析、等电点沉淀或有机溶液沉淀等方法。（3）细分级分离 粗分级分离步骤已经将大部分杂蛋白除掉，细分级分离可以将样品进一步纯化。一般用凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等

41、方法。又是还可以采用各种电泳方法。（4）结晶 这是分离纯化的最后一步，结晶和重结晶可以进一步纯化蛋白质。蛋白质的结晶不仅是纯度标志，还表明蛋白质处于天然状态，没有发生变性。例题3-6：凝胶过滤层析与凝胶电泳中的分子筛效应有什么不同？为什么？解：这两种分离方法的原理不同。在凝胶过滤层析中，分子量大的蛋白质不能进入凝胶孔隙内部，只能穿过凝胶颗粒之间的间隙，很快流出层析柱。因此，分子量大的蛋白质，移动的路径短，移动速度较快；分子量小的蛋白质，移动的路径长，移动速度较慢。而在凝胶电泳中，整个凝胶是一个完整的空间网状结构，分子量大的蛋白质与分子量小的蛋白质都必须穿过凝胶，移动的路径是相同的。分子量大的蛋

42、白质在胶孔中的摩擦力较大，移动速度较慢，分子量小的蛋白质在胶孔中的摩擦力较小，移动速度较快。例题3-7：什么是蛋白质的变性作用？引起蛋白质变性的因素有哪些?解：蛋白质的变性作用，是指蛋白质高级结构被破坏。蛋白质的天然构象解体，多肽链由有序状态成为伸展松散的无规则状态。变性作用一般不涉及肽键的断裂，而主要是次级键断裂。变性后的蛋白质，溶解度降低，粘度增加，失去生物活性，失去结晶能力，易被蛋白酶水解。引起蛋白质变性的因素有两大类：物理因素：高温、高压、紫外线、超声波。化学因素：强酸、强碱、重金属、变性剂。例题3-8：蛋白质化学研究中常用的试剂有：溴化氰，尿素，b巯基乙醇，胰蛋白酶，过甲酸，丹磺酰氯

43、，6 mol/L盐酸，茚三酮，异硫氰酸苯酯，和胰凝乳蛋白酶。为完成下列各项实验，请选择最合适的试剂。A.一个小肽的氨基酸序列测定B.多肽的N末端氨基酸测定C.一个不含二硫键的蛋白质的可逆变性D.芳香族氨基酸残基的羧一侧肽键的水解E.甲硫氨酸的羧基一侧肽键的裂解F.通过氧化途径将二硫键打开解：A. 小肽的氨基酸序列测定用异硫氰酸苯酯B. 多肽的N末端氨基酸测定用丹磺酰氯C. 不含二硫键的蛋白质的可逆变性用尿素D. 芳香族氨基酸残基的羧一侧肽键的水解用胰凝乳蛋白酶E. 甲硫氨酸的羧基一侧肽键的裂解用溴化氰F. 通过氧化途径将二硫键打开用过甲酸 例题3-9：多聚谷氨酸在pH3.0以下的水溶液中形成螺

44、旋，而在pH5.0以上的水溶液中却为伸展状态，试解释这个现象。在什么pH条件下，多聚赖氨酸会形成螺旋？解：氨基酸侧链基团的解离性质对螺旋的形成有很大的影响。由单一一种氨基酸构成的聚合物，只有当侧链基团不带电荷时才能形成螺旋。因为相邻残基的侧链上带有同种电荷会产生静电排斥力，阻止螺旋的形成。谷氨酸侧链的pKa为4.1，在pH3.0以下的水溶液中多聚谷氨酸侧链几乎不带电荷，能够形成螺旋。在pH5.0以上的水溶液中，多聚谷氨酸侧链几乎全部带负电荷，不能形成螺旋，呈现伸展状态。赖氨酸侧链的pKa为10.5，当pH远高于10.5时，多聚赖氨酸的侧链不带电荷，可以形成螺旋。当pH远低于10.5时，多聚赖氨

45、酸的侧链带正电荷，呈现伸展状态。例题3-10：试解释下列现象。用热水洗涤羊毛衫时，羊毛衫会变长，但是在电热干燥器内干燥时，羊毛衫又会收缩。而丝绸制品经过同样的处理却不收缩。解：羊毛纤维的多肽链的基本结构单位是螺旋，每个氨基酸残基沿螺旋的轴向长度是0.15nm。在加热条件下，纤维中的部分螺旋转化为折叠构象。折叠中每个氨基酸残基的轴向长度是0.650.7nm，所以羊毛纤维伸展变长。当干燥以后，多肽链又由折叠构象转变为螺旋构象，羊毛纤维收缩。丝绸纤维中主要是丝心蛋白，多肽链由折叠构象组成，在加热条件下不会发生螺旋构象与折叠构象之间的转化，因此丝绸纤维在热水洗涤和干燥时基本不会出现伸展和收缩现象。 例

46、题3-11：有一蛋白质，在某组织内含量较低，很难分离提纯，现已知其分子量，并从其它实验室要来该蛋白质的抗体，问用哪些实验方法可以初步证实组织内的确含有该蛋白质?解：先用根据这种蛋白质的分子量，选用一定浓度的聚丙烯酰胺作用分离胶，用SDS-PAGE分离从该组织中所提取得到的蛋白质。然后，用蛋白质印迹技术，转移到特定类型的薄膜上，最后用酶联抗体进行检测，观察一种分子量的蛋白质条带是否呈阳性反应。如果呈阳性反应，则初步证实组织内的确含有该蛋白质。例题3-12：假定蛋白质是在pH7.0低离子强度的溶液中,下述蛋白质的哪些氨基酸残基能形成:(1)螺旋；(2)折叠；(3)无规则卷曲；(4)二硫键。Ile-

47、Cys-Pro-Val-G1n-His-Tyr-Thr-A1a-Phe- Cys-Trp-Leu-Met-Pro-C1y-G1y-Hypro-Phe- Gly- 5 10 15 20 Ala-Gly-Ala-G1y-Ser-Gly-Ala-Gly-Ile-Glu- Asn-Glu-Gln-Asn-Met-Ala-His-Phe-Trp- Tyr- 25 30 35 40LYs-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Cys-Glu-Ile-Gly- Ser-G1y-Ser-Gly-Ala-G1y-Ser-G1y-Arg- Arg-45 50 55 60Lys-Gly-Arg-Gly-Arg-P

48、to-Hypro 65解：(1)螺旋：414，2940 (2)折叠：20-28和58-50形成反平行的折叠。 (3)无规卷曲：1519，4149(带电荷的残基)，5965。 (4)二硫键：2位或11位的Cys可以和47位Cys形成二硫键。例题3-13：根据以下实验结果推断一多肽链的氨基酸序列。 (1)酸水解和氨基酸组成为Ala2，Arg，Lys2，Met，Phe，Ser2。 (2)羧肽酶A水解得一氨基酸为Ala。 (3)胰蛋白酶水解得四个肽段，其氨基酸组成如下： Ala，Arg Lys，Phe，Ser Lys Ala，Met，Ser。 (4)溴化氰水解得两个肽段，其氨基酸组成如下： Ala，A

49、rg，Lys2，Met，Phe，SerAla，Ser。 (5)嗜热菌蛋白酶水解得两个肽段，其氨基酸组成如下： Ala, Arg, Ser Ala,Lys2,Met, Phe, Ser。解：从(1)可知该肽为九肽。 从(2)可知其C端为Ala。 从(2)(3)和胰蛋白酶的专一性可知如下肽段： (A)Ala-Arg (B)(Phe，Ser)-Lys (C)Lys (D)(Met，Set)-Ala 从(4)和(2)可知：(E)Met-Ser-Ala 从(5)和嗜热菌蛋白酶的专一性可知：(F)Phe-(Ala，Lys2，Met，Ser) 从(E)和(F)可知：(G)Phe-Lys-Lys-Met-Ser-Ala 从(A)(B)(G)可知该肽的氨基酸序列为Ala-Arg-Ser-Phe-Lys-Lys-Met-Ser-Ala例题3-14：有三种未知的蛋白质A、B、C。一种蛋白质主要是螺旋构象。另一种主要是折叠构象。还有一种是三股螺旋的胶原蛋白。用氨基酸分析仪测定了每种蛋白质的氨基酸组成。结果如表31所示，你能指出哪种蛋白质相应于哪种构象吗?为什么?表3-1 三种蛋白质的氨基酸组成（摩尔百分数）蛋白质ABC蛋白质ABCAla29.45.010.7Leu0.56.92.4Arg0.57.25.0Lys0.32.33.4Asp1.36.