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文档简介

1、Q-PCR实验流程一、 实验前准备,每天早上到实验室后,先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。超净台前做实验,需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套,RNA抽提需带口罩。取EP管/枪头时需用镊子,不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后,袋子及时封好。橡胶手套须放入超净台照射紫外,实验操作过程中不得带出超净台,移液器在一天工作结束后调至最大量程,并用75%乙醇清洁移液器,枪头盒及超净台面。实验进行的过程中或观看实验时,没有带口罩不要在超净台前讲话。二、 总RNA抽提1)细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后,用1ml枪将PBS吸干净,加入1ml Trizol (Invitrogen

2、)溶液,吹打混匀,并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解,室温静置5min;组织样品用液氮充分研磨,加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液,混匀,室温放置5min使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称)2) 加入200l氯仿,剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触,室温静置3-5min;(离心时离心管按顺序排放,离心完毕,离心管的顺序也按顺序排好,与第一步的顺序一致)3) 4下,14,000g离心15min,可见分为三层,RNA在上层水相,移至另一个新的RNase free EP管;(用20-200ul的枪吸取上清,吸上清时,枪头应沿着液面上层吸

3、取上清,枪头不可碰到、吸到中间层)4) 沉淀RNA:加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)(不应用振荡器混匀),室温静置10min;5) 4下,14,000g离心10min,收集RNA沉淀(如离心后仍不见EP管底部有沉淀,应将EP管放置在-80度冰箱过夜,继续在4下,14,000g离心10min,收集RNA沉淀),去上清;6) 用75乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可,不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀),超净台风干;沉淀不能过干或过湿,过干则不易溶解,过湿则乙醇残留。7) 视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。三、去基因组 使用RN

4、ase-free的DNase (Promega),按以下体系配置反应液,37消化30min,65灭活10min。RNA DNase 10 x buffer H2O(RNase free) RNasin 30201039.50.5lllll总体积100l 然后按以下步骤操作: 1) 加入等体积的苯酚/氯仿,上下颠倒混匀,室温放置5min,后14,000rpm,离心15min,取上清。2) 加入等体积的氯仿,上下颠倒混匀,静置分层后14,000rpm,离心15min,取上清。3) 加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6-8次),-20静置15min;4) 4下,14,000g离心15min,收集

5、RNA沉淀,去上清;5) 用75乙醇洗涤两次(12,000g离心5min),超净台风干;6) 加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。四、总RNA纯度和完整性检测1) 纯度检测:取1l RNA样品50倍稀释,在核酸蛋白检测仪上测定OD值,OD260/OD280的比值大于1.8,说明制备的RNA较纯,无蛋白质污染。2) 总RNA完整性检测:取RNA样品1l,1琼脂糖凝胶电泳80V20min,EB染色10min,用凝胶成像系统观察并拍照,总RNA的5s rRNA, 18s rRNA和28s rRNA条带,三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。五、逆转录1. mRNA:1) 在RNase

6、 free的PCR管中配置下列溶液.Total RNA H2O 1.0gl总体积12l2) 将上述溶液吹打均匀,置85保温5min,使RNA变性。随后立即冰上致冷, 以防止RNA复性;3) 在该PCR管中加入下列试剂(Promega)oligo(dT)Random primer 10mM dNTP RNase inhibitor 5 x buffer M-MLV 0.50.52.00.54.00.5llllll总体积8.0l4) 将上述20l反应溶液30保温10min;5) 42保温50min;6) 85保温10min;7) -20保存。2. microRNA:使用茎环逆转录法,原理如下图:1

7、) 在去RNase的PCR管中配置以下溶液.total RNAX个miR逆转录引物 H2O 1.00.5*X gl总体积12.5l2)将上述溶液混匀,85孵育5min,以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上,以防止RNA复性再次恢复二级结构;3) 在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液:10mM dNTP (promega) RNase inhibitor (promega) U6逆转录引物5x buffer M-MLV (promega) 2.00.50.54.00.5lllll总体积7.5l4) 将3)溶液加入到1)溶液中,混匀后30保温10min; 5) 42孵育50min;6) 8

8、5孵育10min灭活逆转录酶。四、定量PCR检测1.引物测试:根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率,具体反应体系和反应条件如正式实验,每对引物需做模板水对照。得到结果后,首先根据熔解曲线判断引物特异性,选择标准为:单峰且峰形偏窄、水对照无明显引物二聚体熔解曲线峰。若设计的多对引物熔解曲线均显示特异性良好,则应对比各引物的扩增曲线,优先选择Ct值小、扩增效率高的引物进行正式实验。2确定上机内容后,首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序。(1)一个样品的加样尽可能安排在同一行(2)如正式实验中三次重复不能安排在同一板上,则需把三次重复中的实验分开,但同一次重复的实验

9、不能分开两板3正式实验:体系配制:H2O 4ulSYBR Green PCR Master Mix 10ul (TOYOBO)(使用前需振荡均匀)上游引物 0.5ul (10uM)下游引物 0.5ul (10uM) 总体积 15ul计算好实验中需用多少份体系,则按具体量配置。体系分装会有损失,一般多配0.5份-1份体系。总的体系配好后,在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀,然后15ul每管分装至8连管中。3cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度,一般为1:20稀释,如遇到基因表达低的样品,则适当降低稀释比例至1:10或1:5。cDNA按一定顺序排好后,即可加至刚配好的反应体系中。加样完毕,盖好八连管盖,

10、并在八连管盖最上沿的边上标记好1-12的顺序(不可将标记写在反应管的盖子上,八连管盖避免裸手触摸中间透明的荧光采集区域,且保证每孔均盖紧,否则影响重复性或可能出现熔解曲线峰漂移。)4把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。五上机:5.1 先开电脑,进入Windows 界面。接着打开PCR仪电源开关。5.2 打开7500软件,选择“新建”,在“Template”下拉菜单中选择“60”或“65”(普通基因检测为“60”,MicroRNA检测为“65”)5.3 打开样品架,放入八连管,关上样品架,并在软件上选择已放反应管的孔位,剔除无反应管的孔位。5.4 点击File菜单中Save,输入要保存结果的文件名,命名为日期-上机时间-客户名字简写,如-1008-WL表示8月30日10点08分魏立的实验。5.5 点击Start键,开始运行程序。5.6 程序运行完毕后,

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