生物化学：10复制

1、基因信息的传递,第三篇,Genetic information transmission,本 篇 主 要 内 容 MAIN CONTENTS,复制（replication） 转录（transcription） 翻译（translation） 基因表达调控(control of gene expression) 5. 基因重组与基因工程 （genetic recombination 2. 53核酸外切酶活性; 3. 35核酸外切酶活性.,3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5,5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | |

2、| | |,?,目 录,53 的聚合活性:DNA链的延伸(DNA elongation)； 35外切酶活性：即时校对（instant proofreading）； 53外切酶活性：切除引物(cut off primer)。,1. 原核生物的DNA聚合酶,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,DNA-pol （109kD）,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol ,DNA-pol （120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。 它参

3、与DNA损伤的应急状态修复。,功能 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-pol (250kD),2. 真核生物的DNA聚合酶,四、复制保真性的的机制,1. 严格遵守碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3. 复制出错时DNA-pol的及时校读功能。,五、复制中的分子解链及DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白,1. 解螺旋酶(helicase) 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链 2. 引物酶(primase) 复制起始时催化生成RNA

4、引物的酶 3. 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整,4. DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase),解链过程中正超螺旋的形成,目 录,拓扑异构酶作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶 拓扑异构酶,分 类,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制,

5、5、DNA连接酶(DNA ligase),作用方式:连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,功能： DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,目 录,DNA生物合成过程 The Process of DNA Replication,第三节,（一）复制的起始,需要解决两个问题：,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 合成引物，提供3-OH末端。,一、原核生物的DNA生物

6、合成,DNA生物合成的基本过程:起始、延伸、终止,E.coli复制起始点 oriC,TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA,58 66 166 174 201 209 237 245,串联重复序列,反向重复序列,5,3,5,3,1. DNA解链,AATAGGTGT,AATATGTGT,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,2. 引发体和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,5,（二）复制的

7、延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,目 录,先导链(leading strand)的合成,目 录,后随链(lagging strand) 的合成,目 录,复制过程简图,目 录,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,（三）复制的终止,随从链上不连续性片段的连接,目 录,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,二、真核生物的DNA生物合成, 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。 蛋白

8、激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。, 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。,（一）复制的起始,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,（二）复制的延长,染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接

9、，复制子之间的连接。 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。,（三）复制的终止,？,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,目 录,复制后染色体末端粒的溢缩现象 端粒及端粒酶,功能：, 维持染色体的稳定性 维持DNA复制的完整性,结构特点：, 由末端单链DNA序列和蛋白质构成。 末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短 序列。,端粒：指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白(human telomerase associate

10、d protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT),端粒酶的催化延长作用,爬行模型,目 录,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,目 录,逆转录和其他复制方式 Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways,第四节,1. 逆转录(reverse transcription):以RNA为模板,合成DNA的过程。 2. 逆转录酶(reverse transcriptase)：三种活性 （1）依赖RNA的DNA聚合活性； （2）RNase活性； （3）依

11、赖DNA的DNA聚合活性。,一、逆转录病毒和逆转录酶,3. 逆转录病毒细胞内的逆转录过程(体内转录),应用:获取基因工程目的基因的重要方法之一。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,4. 试管内合成cDNA(体外转录),cDNA complementary DNA,二、逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。 对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,1. 滚环复制(rolling circle replication),三、滚环复制和D环复

12、制,某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。,滚环复制,目 录,2. D环复制(D-loop replication),线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。,DNA损伤（突变）与修复 DNA Damage (Mutation) and Repair,第五节,overview,1.突变的概念(concept) 2.突变的意义(significance) 3.突变的因素(induced factors) 4.突变的类型(types) 5.DNA的损伤及修复(damages and repair) (1)光修复(photo repair) (2)切

13、除修复(incision repair) (3)重组修复(recombination repair) (4)SOS修复(SOS repair),一、突变（mutation）的概念 遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。,在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNA damage)。,从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。,二、突变的意义,1. 突变是进化的分子基础 2. 突变导致基因型改变 3. 突变导致死亡 4. 突变是某些疾病的发病基础,镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基,正常成人Hb (HbA)亚基,Gene Mutation,Cause: Sick

14、le Cell anaemia,三、引起突变的因素,1. 物理因素 紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射,2. 化学因素,目 录,三、突变的分子改变类型,错配 (mismatch) 缺失 (deletion) 插入 (insertion) 重排 (rearrangement),DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。,（一）错配,（二）缺失、插入和框移,缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。,插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失或插入都可

15、导致框移突变 。,缺失引起框移突变,（三）重排,DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,目 录,四、DNA损伤的修复,修复(repairing) 是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,光修复(light repairing) 切除修复(excision repairing) 重组修复(recombination repairing) SOS修复 (SOS repairing),修复的主要类型,是对UV诱发的T-T二聚体。修复发生在320-370nm的蓝光中。,1949年Albert Kelner发现的。,（1）修复酶：,光复活酶（

16、photoreactivation enzyme, PRE）,（2）修复机理,PRE被光子激活，直接切断T-T之间的交联键。,（一） 光修复（photoreactivation repair）,T-T dimer,光修复酶(photolyase),UV,（二）切除修复,是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-pol和连接酶完成。,E.coli的切除修复机制,目 录,（三）重组修复（recombination repair）,Miroslav Radman首先在切除修复缺陷型菌株中发现的。主要是修复uvr系统未彻底清除的T-T dimer。复制后修复（post-replication repair）,（四）SOS修复,当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。 特点： DNA复制时遇到损伤位点并不停下或跳过，而是继续向前复制，但并不保证碱基配对的准确性。是一种但求保命的应急行为。又称为差错倾向修复（error prone repair）。 修复过程