现代科技综述知识文库：流式细胞仪

1、现代科技综述系列流式细胞仪科技是人类区别于动物的重要文明之一，是人类对自然规律研究和利用的学科。本文提供对科技基本概念“流式细胞仪”的解读，以供大家了解。流式细胞仪又称荧光激活细胞分类仪(FACS)或流式细胞术(FCM)。它是当代激光、电子学、流体力学、光学精密机械、计算机、荧光染料、细胞生物学、分子免疫学等学科技术高度发展的产物，具有很强的数据采集及分析、分选功能。特别是在细胞分类、分析细胞表面标志、核酸含量等方面，有其独特作用，是近代生物学、医学领域中最先进的仪器之一。1964年，库尔特(WCoulter)等介绍了FCM的应用技术。但此后的10多年间没有受到应有的重视。80年代以后，FCM

2、得到快速发展和广泛应用。尤其是近年来激光、光学精密仪器、计算机等学科技术的高度发展，使FCM的性能不断完善，从而可以快速进行细胞分类，定量地测定核酸含量、酶活性、细胞体积、细胞膜表面受体和抗原等成分，在细胞生物学、细胞生理病理学、细胞遗传学、免疫学、血液学、药物学、海洋生物学、植物学等方面有着广泛应用。FCM由样品处理和输出系统、检测系统、电子计算机和数据分析系统3个集成部分组成。其工作原理并不复杂，通过流体力学的作用，让样品中的细胞排成单行，以稳定的速度同方向通过检测区。在检测区内，预先经过特定荧光素染色或细胞化学处理的细胞，在聚焦激光束照射下，产生荧光和散射光信号。信号的强弱与细胞内各种组

3、分如核酸和蛋白质等的含量成正比，通过测定荧光信号的强度，即可知道细胞内各组分的含量。不同物质具有不同荧光光谱，如经吖啶橙染色的细胞，其RNA发红色荧光，DNA发绿色荧光，这样仪器就可以同时测定RNA和DNA。细胞的散射光信号是由细胞的衍射、折射光和反射光组成的，它取决于细胞的大小、形状、密度和染料的吸收等。用光电倍增管测定细胞的90散射光，以获得细胞表面结构等方面的信息；用光电探测器检测细胞的小角(如052)散射光，用于测定细胞的大小等。把各光电探测器检测到的荧光信号和散射光信号转换成电脉冲，送到信号处理单元，脉冲高压取决于接受光的大小。综合电脉冲的高低、宽度、面积，用计算机综合分析出细胞的大

4、小、表面标记、内部结构，从而对每次测到的细胞作出准确评价，并以单参数直方图、双参数直方图或三维图的方式表示，实时显示出来。也可以把结果存盘或打印出来。FCM的精确度可通过荧光微球的变异系数(HFCV)来反映。通常，分析免疫荧光时，要求对数绿色荧光(LGFL)的HFCV5%，前向散射光(FLS)的HFCV3%；分析核酸(DNA或RNA)含量时，要求红色荧光(RFL)的HFCV至少15%。因此，每天开机时，应根据分析内容核查荧光微球的HFCV是否在允许值之下，若高出允许值，应校正仪器的精密度。FCM分选细胞的速度及纯度是目前任何其他医学仪器无法比拟的。其分选速度可高达30005000个细胞s，纯度

5、可高达99%以上。在流动室上安装一个超声振荡器，从喷嘴往下喷射的液流在该振荡器的作用下被打断成一个接一个的液滴，细胞也被分散在这些小液滴中。通过光电检测器测定细胞的各种信号，如果信号满足预定的条件，即对应于所要收集的细胞，电子线路就产生一个电脉冲。该电脉冲在液流快要形成液滴时，通过电极对细胞充电，此时含有细胞的液滴就带有电荷。根据不同的要求，可对液滴分别充以正电和负电，使其通过一对偏转板时产生偏转。于是，带不同电荷的细胞在静电场的作用下，落在两个不同的试管里。1983年，巴洛吉尔(BBarlogie)等研究和总结了FCM临床诊断肿瘤病的资料，发现细胞DNA含量异常增加，对恶性肿瘤的诊断具有结论

6、性意义。巴洛吉尔认为，利用FCM测定肿瘤细胞DNA含量的动态变化，可作为指导肿瘤治疗、了解病情发展过程、预后等的考虑参数。FCM还可用于宫颈癌细胞的自动甄别，用于分析痰样品以诊断肺癌，用于分析尿样品以检查膀胱表皮细胞癌等。1979年，克里桑(AKrishan)等报告，FCM可用于研究抗癌药物的疗效和最佳的给药时间，是研究癌细胞被杀伤与恢复情况的有效工具。1983年，海德利(DWHedley)建立了石蜡包埋组织FCMDNA含量分析法，进一步开拓了FCM在临床应用的新领域，适用于通过短期的回顾性分析以明确肿瘤的发生发展及临床转归之间的联系。利用免疫荧光方法结合使用FCM，能辨认和计数带有不同表面特

7、异性抗原的细胞。比如利用荧光素标记的免疫球蛋白，可以鉴别免疫活性或非活性的淋巴细胞，并且进一步可以把两者分开，以供免疫学研究。借助某些试剂，利用FCM可分析单克隆抗体，可测定和鉴别T淋巴细胞和B淋巴细胞及其亚群，用于研究免疫系统的功能，研究白血病、淋巴瘤、艾滋病及其他免疫缺陷疾病。用FCM测定细胞染色体的形状和其中DNA的含量，可得到染色体的频率分布信息，发现某些遗传病综合征患者白细胞染色体(XXY)与正常男性的白细胞的染色体(XY)中DNA含量的不同。FCM也可通过妊娠妇女血液检测胎儿的细胞，并有足够的灵敏度早期测定胎儿的性别。该技术还可扩展到动物的人工授精方面。T淋巴细胞亚群在机体细胞免疫

8、的调控和效应中起主导作用。检测T淋巴细胞亚群，已成为基础医学和临床研究观察免疫状态的主要指标。1980年，霍夫曼(RAHoffman)等建立了T淋巴细胞亚群的全血溶解染色及使用FCM分析结果的方法。实践证明，FCM分析全血染色的T淋巴细胞亚群具有快速、客观、不失真等优点。1986年，桑斯韦特(JTThornthwaite)等总结31例艾滋病的T亚类细胞及THTs的比值情况，结果发现，31例中OKT4细胞的百分数全部低于正常，Ts的百分比全部高于正常，THTs的比值全部下降。如今，FCM已成为诊断和研究艾滋病的要工具。1984年，卡普(JECupp)等应用FCM检查母体血液中存在Rh(+)或抗D

9、抗原阳性的细胞，证实其有很高的敏感性，每1000100000个红细胞中含1个阳性细胞即可检测出来。在母体妊娠过程中，检测是否存在Rh()或抗D阳性的细胞，以了解胎儿可能遭到因Rh血型不合而发生严重溶血的后果，对指导治疗有重要意义。FCM可用于对B淋巴细胞增殖性疾病的诊断，此类疾病包括各种多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链症、轻链症等，诊断的准确率较高。用于其他方面的研究尚有：(1)用于检测血液中的大肠杆菌；(2)研究EB病毒受体在细胞上的分布、存留和再生情况；(3)研究郎罕氏细胞的不同亚群；(4)研究哺乳动物精子的发生和形态的测量等。FCM的某些性能目前尚不完善，主要难点在于：(1)要设计加工一

10、个更精密的流动室和流动系统，使细胞高速地排成一行，逐个按顺序通过激光照射区；(2)由于细胞很小，其荧光信号与散射光信号较弱，所以要设计大数值孔径的显微镜并使用合适的挡光杆、光阑、双色分光片、干涉滤光片等光学器件，以便收集尽量多的光信号；(3)要用高灵敏度低噪声的光电探测器和放大器以及各种高性能的电子线路；(4)设计微机多道脉冲分析器和编写相应的软件，对大量的数据进行采集和处理，仪器可进行单参数的、双参数的定时或定量采集。更主要的是，FCM价格昂贵、操作复杂，因而限制了它的推广应用。如能针对上述不足加以改进，将会使其在更广泛的范围内发挥作用。【参考文献】： 1 Titus J A,et al. Proc Natl Acand Sci. USA,1981,78:519 2 Jerry A,et al. Expl Cell Bial,1981,49:1 3 Kenneth A A. Diagnostic Immunology