用16S rDNA方法鉴定细菌种属;

1、用16s rdna方法鉴定细菌种属一、实验目的1. 掌握16s rdna对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握dna提取、pcr原理及方法、dna片段回收等实验操作。二、实验原理细菌rrna（核糖体rna）按沉降系数分为3种，分别为5s、16s和23s rrna。16s rdna是细菌染色体上编码16s rrna相对应的dna序列，存在于所有细菌染色体基因中。16srdna鉴定是指用利用细菌16srdna序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组dna提取、16srdna特异引物pcr扩增、扩增产物纯化、dna测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。16s rdna是细菌

2、的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌rna含量的80），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。在大多数原核生物中rdna都具有多个拷贝，5s、16s、23s rdna的拷贝数相同。16s rdna由于大小适中，约1.5kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。16srrna的编码基因是16srdna，但是要直接将16srrna提取出来很困难，因为易被广泛存在的rnase降解，因而利用16s rdna鉴定细菌，其技术路线如下：细菌

3、培养液基因组dna16s rdna片段连接克隆载体阳性克隆鉴定测 序片段回收dna提取pcr扩增细菌基因组的提取：得到胞内可溶物质菌体破碎纯化dna分离出dnapcr的基本原理 ：pcr技术的基本原理 类似于dna的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。pcr由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 模板dna的变性：模板dna经加热至93左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板dna与引物的退火(复性)：模板dna经加热变性成单链后，温度降至55左右，引 物与模板dna单链的互补序列配

4、对结合； 引物的延伸：dna模板-引物结合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna 链互补的半保留复制 链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。二、操作步骤1、细菌基因组dna提取；2、pcr扩增；3、细菌基因组dna及pcr产物的电泳检测；4、扩增片段回收；5、dna片段测序。三、结果处理与分析在回收扩增片段时，紫外灯下条带呈现绿色荧光，将凝胶中绿色荧光部分切割分离出来，放入已称重的2ml离心管中，空的离心管为1.02g，放入回收的凝胶后为1.42g，

5、则凝胶为400mg，因此加入的binding buffer为1200l。我们小组选用b1 16s sequence，以下为制作进化树过程：1、根据b1 16s 基因序列，到ncbi 上比对，确定其种属（1）ncbi 主页（/）依次点击进入blast （2）选择nucleotide blast（3） 将b1 序列复制到文本，框里choose search set 处点复选按钮others，最后点blast（4） 点击blast后，数据进行提交。blast 结果如下：图中“evalue” 指标与其他指标不同，它的数值越小相似程度越高，其他几个（如

6、totle score）都是数值越高相似度越高。我组将数据按照query cover从100%开始从大到小排列，从不同相似度一共选出14组数据。（5）导出数据数据导出格式选择fasta：（6） 选择大肠杆菌作为外属，导出大肠杆菌（7） 下载meg并安装，我组使用的是mega5.02，并将b1序列导入meg（8） 通过edit中的copy及paste将b1序列和大肠杆菌序列导入我们选中的14个序列中（9） 选择w 中align dna，然后点击ok（10）选择date中的mega format，生成meg文件（11） 打开.meg文件（12） 生成进化树（13） 导出文件，我组导出pdf格式2、

7、 进化树b1应该属于proteus（变形杆菌属）电泳图谱：从右数第四个条带为本组电泳条带，条带清晰且明亮，无明显拖尾以及弥散，表明dna提取和pcr扩增非常顺利，所得目的片段完整，数量较多。四 交流与讨论1.细菌中包括有三种核糖体rna，分别为5s rrna、16s rrna、23s rrna，rrna基因由保守区和可变区组成。16s rrna对应于基因组dna上的一段基因序列称为16s rdna。5s rrna虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23s rrna含有的核苷酸数几乎是16s rrna的两倍，分析较困难。而16s rrna相对分子量适中，又具有保守性和存在的普

8、遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此我们选择16s rrna进行提纯测序2.用试剂盒提取rna，一定要注意盒内药品名称，不要弄错3.提取dna过程中，加入ga缓冲液后，一定要小心吹打混匀，但要注意不要产生气泡。4.制作pcr扩增产物的过程中，第一步要先加水，因为dna液和其他药品太少，不事先加水，会是使其他样液加到离心管壁上或根本加不进来，造成样液损失。5.我组的dna电泳虽然亮度略低，但是pcr产物条带清晰明亮，同时并无拖尾现象，说明我组dna扩增之后含量很高，而且质量也很好6.pcr反应五要素：引物(pcr引物为dna片段，细胞内dna复制的引物为一段rna链）、酶、dntp、模板和缓冲液（其中需要mg2+作为聚合激活剂）。通过这次实验我学到了鉴定细菌种属的一种方法，16sr dna法，虽然按照试剂盒进行实验操作非常简单，但这次实验的目的并不在于完成一次实验得到实验结果，而在于通过这一次实验学会举一反三，切实地应用到以后的科研实验中去。关于试剂盒的使用，我们不仅要明白如何使用，更要清楚其原理，明白用代称命名的一些试剂的用途以及可能成分，这非常有利于以后的科研工作。同时，操作过程中严格按照步骤进行，注意试剂的使用不要出错。电泳图谱中第一块胶是提完dna之后、进行pcr之前的样品所跑的电泳条带，能看出条带