分子生物学--转录与转录后加工.ppt

1、transcription and post- transcriptional processing(转录和转录后加工),主要内容,转录 概述 原核生物RNA聚合酶 原核生物转录过程 真核生物转录特点 真核生物基因的启动子及转录起始复合物的组装,转录后加工 rRNA前体的加工 tRNA前体的加工 mRNA前体的加工 RNA的自我剪接 真核mRNA前体的剪接 真核mRNA前体的选择性剪接 RNA的编辑,主要内容,transcription,（一）概述,以DNA为模板合成RNA的过程 。,转录和DNA复制的区别,Template(模板),模板链(template strand)：反义链(anti-

2、sense strand) 非模板链(non- template strand):编码链(coding strand),有意义链(sense strand),different genes may use different strands as template,（二）原核生物RNA聚合酶,E.coli RNA聚合酶,全酶 (holoenzyme)： 2 ,核心酶 (core enzyme)： 2,DNA指导的RNA聚合酶 DNA dependent RNA polymerase(DDRP),细菌中单一类型的RNA聚合酶负责合成所有的RNA。,利用SDS-PAGE从E.coli RNA聚合酶

3、中分离各个亚基,因子的结构,70因子的一级结构,因子与启动子的特异性相互作用,E.coli与枯草杆菌各的因子同源区,结合核心酶后,（三）转录过程,+1,transcribed region,1. template recognition（模板的识别） 2. Initiation(起始) 3. elongation(延伸) 4.termination（终止）,原核生物转录过程,启动子（promoter）：RNA聚合酶识别，结合并 开始转录的一段DNA序列。,模板的识别,五种不同启动子的共同顺序 箭头表示突变，向上表示增加转录水平，向下表示降低转录水平,因子对RNA聚合酶与DNA结合的影响,因子使

4、RNA pol特异性的识别启动子,因子的更替可控制转录起始,转录的起始,RNA链的合成方向53,转录的延伸,循环:RNA聚合酶与启动子结合,使DNA局部熔解,当转录延伸时, 因子与核心酶分离,与其它新的核心酶结合,起始新的转录事件.,转录的终止,终止子（ terminator ）：提供终止信号的DNA序列。,不依赖因子的终止子:,简单终止子，又称内在终止子（Intrinsic terminator） 转录终止不依赖任何辅助因子。而依靠转录产物形成特殊的茎环二级结构,有茎环结构，富含GC 茎环结构后有寡聚尿苷,依赖因子的终止子 （rho-dependent terminators ）,穷追(Ho

5、t pursuit) 模型,通读(read-through)：某些因子可使酶越过终止子继续转录。 抗终止因子(anti-termination factor)：引起抗终止作用的蛋白质。 常见于某些噬菌体的时序控制,通读,典型的真核细胞转录产物是单顺反子mRNA,（四）真核生物转录特点,真核细胞转录和翻译在时间上和空间上都是分开的，转录在细胞核，翻译在细胞质。,真核细胞RNApol高度分工 启动子更复杂和更多样性，不同的RNA聚合酶有不同的启动子 真核生物转录需要许多转录因子(transcription factor,TF）的参与。 真核基因DNA的顺式作用元件比原核复杂得多 真核生物的转录调控

6、以正调控为主。,转录因子（transcription factors）,Definition: 转录起始所需要的，而非RNA聚合酶 本身组分的任何蛋白质,Functions: Binding to DNA Recognizing another factor Recognizing RNA Pol Incorporating into initiation complex,转录因子（transcription factors）,转录因子（transcription factors）,Classification：,普遍性转录因子：使RNA聚合酶结合到启动子上， 形成前起始复合物。其作用相对较弱

7、，仅在 本底水平上支持转录并实施最小程度的调控。 又称通用因子,转录调控因子：通过与启动子及增强子等调控元件结合 而调控转录活性的蛋白因子 包括上游因子和可诱导因子,是在所有启动子的RNA 合成中都是必需的。,是能够识别并结合转录起始位点上游的特异性短序列的DNA 结合蛋白。普遍存在，且活性不被调控。,在特定的时间或特定的组织被激活或合成，能控制转录在特定的时间和地点进行的一类因子。,转录因子（transcription factors）,顺式作用元件（Cis-acting elements）,Definition: 指与基因 表达调控相关、能够被调控蛋白 特异性识别和结合的特异DNA序列。

8、包括启动子、增强子，负调控元件等,反式作用因子(Trans-acting factors),Definition: 指真核细胞内通过与 顺式作用元件相互作用 而调节基因转录活性的蛋白质因子。,S1核酸酶图谱技术 引物延伸法,测定转录起点的方法,（五）真核生物基因转录起始的几种研究方法,1. S1核酸酶图谱技术,2. 引物延伸法,1. 5端缺失系列分析法: 常用于测定哺乳动物基因调控区的上游边界,研究顺式作用元件结构的方法,5端缺失系列分析法,2.接头扫描突变法,可以找出存在于基因转录起始位点和5端边界之间的所有调控元件 方法的基础是构建一系列序列重叠的调控区突变体，每个突变体内各有一个短序列的

9、核苷酸序列被打乱， 然后分别转染培养细胞，或微量注入爪蟾卵母细胞，并分析它们对报告基因的影响,接头扫描突变法机制,疱疹病毒胸苷激酶基因启动子的连接扫描突变,（六）真核生物RNA聚合酶,1.真核细胞的三类RNA聚合酶,-鹅膏蕈碱的结构,鬼笔鹅膏菌是一种能产生-鹅膏蕈碱的毒磨,RNA聚合酶对-鹅膏蕈碱的敏感性,U6snRNA, 7SLRNA, 7SKRNA,老鼠肝脏细胞三类RNA聚合酶在离子交换层析中的分离,RNA聚合酶I定位于核仁,RNA聚合酶II和III定位于核质,Eukaryotic RNA pol II has 10 subunits,2.RNA聚合酶II,酵母RNA聚合酶II有12个亚基

10、,RNA聚合酶II最大亚基的异质性,CTD: carboxyl terminal domain（C末端结构域） Amino acid sequence: Tyr Ser Pro Thr Ser Pro Ser Target for kinase Function: trigger initiation,老鼠浆细胞RNApol II部分亚基结构,o、a、b是最大亚基的三种形式与酵母的RNA pol II的Rpb1相对应,c是与酵母的Rpb2相对应,RNA pol II最大亚基不同形式间的相互关系,IIa是CTD未被磷酸化的形式，主要负责转录的起始 IIo是CTD被磷酸化的形式，主要负责转录的延伸

11、 IIb是被蛋白酶消化而失去CTD的形式,the crystal structure of RNA polymerase II from yeast,（七）真核生物基因的启动子 及转录起始复合物的组装,类型II启动子,基本启动子 (basal promotor),序列名称 位置 序列 反式作用因子 TATA-box -25 30 TATAAAA TBP,作用是确定精确的转录起始位点，而不起调节转录效率的功能,基本启动子 (basal promotor),序列名称 位置 序列 反式作用因子 CCAAT-box -75 -80 GGCCAATCT CTF、C/EBP GC-box -90 GGGC

12、GG sp1,上游元件 (upstream elements),常表现出细胞类型特异性，功能主要是提高转录的效率和特异性,类型II启动子在转录起始位点周围有保守的序列，是最适表达所需要的。 共同序列为PyPyANT（Py为嘧啶，N为任意碱基）,转录起始位点 (initiation site, Inr),How does a pre-initiation complex form ?,TBP：特异性地结合TATA box TAF ：多亚基，是各种转录因子的靶位点,Functions of TFX,X=A,B,D,E,F,H,formation of platform,TF A: 激活TBP，促进

13、TF D结合于TATA box TF B:结合于TF D-DNA上，确定转录起始位点，在TF F协同下募集RNA pol TF F: 与RNA pol 结合，抑制RNA pol 与DNA的非特异性结合 TF H： ATPase, helicase， kinase TF E ： 促进TF H的激酶活性,Functions of TFX,Assembly of pre-initiation complex(PIC) 转录前起始复合物,DABPolF复合物形成的模型 聚合酶是结合在TFD，A和B结合位点 （TATA box）下游的DNA上,RNA Pol is activated by CTD ph

14、osphorylation,CTD磷酸化后，使CTD中羟基电荷和结构发生变化，影响它与TBP结合的稳定性，使聚合酶从启动子上脱离,TFD,TFH,TFB,TFA,通用转录因子参与转录起始、启动子清除、延伸的模型,a.TBP或TFD，同B、F及聚合酶II形成最基本的起始复合物,添加TFE和H，水解ATP使DNA在起始区解链，CTD部分磷酸化，产生流产转录物，很快停止。,b. 随着ATP提供能量， TFH使DNA进一步解螺旋并使启动子清空,c. CTD进一步磷酸化,NTP不断添加,延伸复合物不断进行RNA的延伸,TBP和TFDB仍留在启动子上，延伸不需要TFE和H，从延伸复合物解离下来,TFIID

15、 中包括至少8 种TBP偶联因子,分子量为30250kD,分别命名为TAF-30250 TAF150 识别起始子(1nr)序列 TAF 是基因转录调控的辅助因子，为各种调控因子提供作用的靶位点 它的作用是将上游调控区和远端调控区结合的转录调控因子与PIC联系在一起，而介导各种反式作用因子对基础转录的调控。,Functions of TAF,来自克隆基因的产物的果蝇TFIID在体外整合的结构图,果蝇、人和酵母TAFs之间的关系,缺乏TATA框的启动子含有其他元件包括Inr和下游元件。TAFII250和TAFII150能结合与这些元件，因而保证了TFIID结合与启动子。 或者特异性调控因子结合与上

16、游启动子元件（UPE），这些特异性调控因子又同一个或数个TAFII相互作用，把TFIID锚定于启动子上。,对缺乏TATA框启动子的起始,TBP与含有TATA框或不含TATA框的启动子的相互作用模型,许多激活因子通过与TAFII相互作用激活起始装置 NTF-1能结合于TAFII-150 Sp1与TAFII-110结合,TAFII介导各种激活因子的作用,真核生物基因转录受激活因子增强的模型,a.最小的TBP/TAF复合物不能支持激活,b.两种不同的三聚体复合物支持Gal4-NTF1的激活作用，但不能支持Sp1的激活,c.包含有TAFII-100的四聚体复合物能介导Sp1的激活作用,d.完整的TFI

17、ID能支持各种激活因子的作用,TAFII介导各种激活因子的作用,类型I启动子,-45 +20,-180 -107,Core promoter,UCE,rRNA的两个元件,Tjian及其同事用接头分区突变法研究人类rRNA基因，结果显示UCE是最佳转录所必需的，但本底水平的转录不一定需要UCE的参与，而核心元件是转录所必需的,Tjian及其同事用接头分区突变法研究人类rRNA基因的UCE和核心元件间插入或缺失不同长度的DNA序列， 证实两个元件间的距离对转录起始也是非常重要的。两者之间插入或缺失碱基对，启动子强度将减弱，而且缺失比插入更敏感。,rRNA的两个元件间的距离对启动子强度的影响,UBF

18、：能结合于UCE和Core promoter SL-1:由TBP(TATA-binding protein)和3种TAF I组成 SL-1本身不能结合于启动子，但能同RNA pol结合 SL-1：使RNA pol I正确的定位在起始位点,RNA聚合酶I的转录起始复合物,RNA POL,RNA聚合酶I的转录起始复合物的装配,类型III启动子,U6 snRNA基因，7SKRNA基因,类似类型II启动子，有TATA框，能与含TBP的转录因子结合,混合启动子：海胆硒代半胱氨酸tRNA(ser)sec基因,Three types of promoters for RNA polymerase III,B

19、y deletion,Internal promoter of 5s rRNA gene: +55+80,3端序列缺失对5SrRNA基因转录的影响,a.Brown及同事对爪蟾5SrRNA基因3端序列进行缺失，于体外进行转录。3端序列缺失但没越过启动子序列，仍能转录，只是产物比全长rRNA短，转录事件的发生表明启动子是完整的， 3端序列缺失到启动子序列，转录终止,b.只有当3端序列缺失延伸到80位时，才无转录产物的合成,transcription factors for RNA Pol ,RNA pol 的转录起始复合物的装配,tRNA基因内启动子,Between SL1、TFB and TF

20、D,1.转录前起始复合物的装配都是由能识别启动子内特异性位点的装配因子开始的。在DNA序列上，它吸纳、招募PIC的其他组分。,转录起始的一般规律,3种聚合酶对不含TATA box的启动子起始前复合物的识别模型,在I,II,III类启动子上，最先结合的组装因子分别是UBF，SP1，TFIIIC，,随后结合含TBP的另一因子分别是SL1，TFIID和TFIIIB。,对I,III类启动子而言足以结合聚合酶起始转录，但II类启动子还需要更多的通用因子参与转录。,2.TBP在所有各种已知类型的真核启动子中起组织作用 3.TBP的特异性由与它偶联的TAFs控制。TBP携带有某一套TAF，它就会在形形色色启

21、动子中结合于某一个启动子位点,post- transcriptional processing,主要内容,rRNA前体的加工(自学) tRNA前体的加工(自学) mRNA前体的加工 RNA的自我剪接 真核mRNA前体的剪接 真核mRNA前体的选择性剪接 RNA的编辑,（一） rRNA前体的加工,原核细胞有3种rRNA ：16S、23S和5SrRNA,真核细胞有4种rRNA：28S、18S、5.8S和5SrRNA,三种rRNA是一个转录单位，一起转录的,原核生物,三种rRNA是一个转录单位，一起转录的,真核生物,4种rRNA，是两个转录单位， 18S、5.8S和28SrRNA的前体是45S，是一

22、个转录单位， 5SrRNA是单独的一个转录单位。 核仁是其转录、加工和装配成核糖体的场所,核酸内切酶在两端切断，E.coli RNAase P是5成熟酶 核酸外切酶: RNAase D从3端逐个切去附加的顺序 3端加上-CCA-OH 核苷酸的修饰,（二） tRNA前体的加工,原核生物,3端加上-CCA-OH,（1）甲基化 如：A Am,核苷酸的修饰,（2）还原反应 如：U DHU,（3）核苷内的转位反应 如：U ,（4）脱氨反应 如：A I,第一步:核酸内切酶切除插入序列，不需ATP； 第二步:RNA连接酶连接，需要ATP。,核tRNA的酶促拼接,由RNA聚合酶III转录， 加工与原核相似，但

23、3端的CCA都是后加的， 还有2-O-甲基核糖。,真核生物,（三） mRNA前体的加工,细菌多数不用加工，转录与翻译是偶联的。 也有少数多顺反子信使RNA必须由内切酶切成较小的单位，然后翻译。,原核生物,初始转录产物：hnRNAs（heterogeneous nuclear RNAs，核内不均一RNA ），是mRNA的前体（pre-mRNA） hnRNA的物理结构是核糖核蛋白 (hnRNP heterogeneous nuclear ribonucleoproteins ),真核生物,mRNA前体的剪接信号,内含子相同的开头和结尾5GU.AG3 内部有个保守的A参与形成分支剪接中间物 3剪接位

24、点AG前有一个嘧啶复含区（PPT）,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后加工,鸡卵清蛋白基因,5端加帽子 3端加尾,剪接（splicing）,成熟的mRNA,（四） RNA的自我剪接(Self-splicing ),型内含子（ group intron ）的自我剪接 型内含子（ group intron ）的自我剪接,型内含子的自我剪接,Group ,The structure of group introns,型内含子的自我剪接,型内含子的二级结构及活性中心,Splicing releases mitochondrial group II introns in the form of lariat

25、s(套索结构).,Definition: 泛指具有催化功能的RNA的分子,核酶（ribozyme）,（五） 真核mRNA前体的剪接,Splicing mechanism: similar to group intron Structure of snRNAs : similar to group intron,Splicesome（剪接体）,snRNA: small nuclear RNA(核内小分子RNA) snRNP: small nuclear ribonucleoprotein(小分子核内核糖核蛋白),:U1、U2、U4、 U5、U6 snRNA,Spliceosomes are ellipsoidal(椭圆形) particles with several discrete regions.,Pre-mRNA,Group ,Mechanism of splicing,酵母细胞中5剪接位点与U6 snRNA相互作用模型,（六） 真核mRNA前体的选择性剪接 （alternative splicing）,Definition: 一个基因的初始转录产物在不同的分化细胞、 不同的发育阶段、甚至不同的生理状态下