Westernblot所需溶液的配制

1、WB 所需溶液的配制1 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 (Running buffer) 5Tris base15.14gGlycine(甘氨酸 )72.0gSDS5.0g蒸馏水溶解至 1000ml5Tris - 甘氨酸电泳缓冲液： 15.1g Tris碱和 72甘氨酸， 5电泳级的 SDS，双蒸水定容至 1L，pH 值为 8.3 。使用前，将 5稀释到 1：取 200ml 5 ，定容到 1000ml。2 转膜缓冲液 （Sending buffer ）（现用现配）1000 ml1500 mlGlycine(甘氨酸 )14.413 g21.6 g1.0MTris.HCl25 ml37.5ml(pH8

2、.3)10% SDS1 ml1.5 ml甲醇 (methanol)200 ml300 ml蒸馏水溶解至 1000 ml溶解至 1500 ml必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。小片段可不加SDS。310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（ Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,C12H25O4NaS）溶液 : 10g SDS ，100ml 去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2 ，室温保存。4Tris.HCl的配置1.0MTris.HClTris 30.28 g加入到 250ml浓盐酸调 pH到 8.8(pH8.8)水中1.5MTris.HClT

3、ris 45.43 g加入到 250ml浓盐酸调 pH到 8.8(pH8.8)水中1.0MTris.HClTris 30.28 g加入到 250ml浓盐酸调 pH到 6.8(pH6.8)水中1.0MTris.HClTris 30.28 g加入到 250ml浓盐酸调 pH 到 8.3 ，(pH8.3)水中需要大约 8 毫升。注： Tris的分子量是 121.4. 4度储存。5 10% APS (Ammonium persulfate ;过硫酸铵 ) 的配置称取 1g 过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到 1.5ml 微量离心管中，负 30 度冻存。 使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可

4、多配。4 度存则两周内用完，最多不能超过一个月。负20 度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。6 10 TBS (Tris-buffered saline)的配置NaCl80 g160 gTris base24 g48 g双蒸水溶解至 1000 ml溶解至 2000 ml加 HCl 调 pH 到 7.6 ，室温储存。7 TBST (Tris-buffered saline with Tween20)的配置10TBS100 ml200 mlTween201 ml2 ml双蒸水溶解至 1000 ml溶解至 2000 ml室温储存。8上样缓冲液（ loading buffer）的配置SDS-PAGE加

5、样缓冲液 :pH6.8 0.5mol/L Tris 缓冲液 8ml，甘油 6.4ml ， 10%SDS 12.8ml ，巯基乙醇 3.2ml ， 0.05%溴酚蓝 1.6ml ，H2O 32ml 混匀备用。按 1:1 或1:2 比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min 混匀后再上样，一般为20-25ul ，总蛋白量 100g。9 stacking gel buffer (4 )Tris base: 0.5M5 ml 1M Tris.HClSDS(w/v): 0.4%0.4ml 1%SDS调 pH 到 6.8 ，加双蒸水到10 毫升。10 5 Sample buffer (10ml)Stacki

6、ng gel buffer5 mlSDS1.0 g巯基乙醇2.5 ml （最后再加）甘油（ glycerol ）2.5 ml溴芬兰（ Sigma B-8026 ）2.5 mg室温储存11 封闭液的配置 Blocking solution要用 TBST配制牛奶5% (w/v) nonfat dried milk或者 1%BSA0.01% antifoam A (Sigma)0.01%(v/v) sodium azide12 丽春红溶液：100 微升冰醋酸，加入0.05 克丽春红，用水稀释至10 毫升。1）4%多聚甲醛（ PFA）的配制（1000 毫升）40 克多聚甲醛，加入 800 毫升水， 6

7、0 度搅拌溶解，加入 300 微升氢氧化钠，全部溶解后冷却到 4 度，再加入 100 毫升的 10PBS，加水定容到 1000 毫升。调pH到 7.2-7.4 。通风橱过滤， 4 度保存。13 组织裂解液10mM Tris- HCl (pH 7.4)48.44mg 粉末或 1M Tris- HCl 0.4ml150mM NaCl350.6 mg1% TritonX-1000.4 ml 100%1%去氧胆酸钠（Sodium400 mgdexycholate ）5mM EDTA74.4 mg 或 0.25M EDTA 3.2 ml1% SDS10% SDS 0.4 mlPMSF (难溶解 )7 mg蛋白酶抑制剂1 片 /10ml步骤：首先加 10-20 毫升的水溶解 EDTA,再加入 0.2%NaOH使溶解，再调 pH至 7.4 ；然后分别加入其他成分， 溶解一个再加另外一个； 去氧胆酸钠开盖后会飞出， 应戴口罩。14. PBS 的配制（ 1000 毫升）（PH 7.27.4 ）NaCL8.00 gKCL0.20 gNa2