实验一 大肠杆菌的分离和培养

1、实验1 大肠杆菌的培养和分离,实验目的：,1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。 2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基本进行细菌的划线培养。 3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。,一、基础知识,(一)微生物: 1.特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.,2.微生物包括五类,病 毒 细 菌 放线菌 真 菌 原生动物,(二)培养基,1.分类(按物理形态分) (1)液体培养基 (2)固体培养基,常用的固体培养基: 琼脂固体培养基. 微生物在固体培养基 表面生长,可以形成

2、 肉眼可见的菌落.,2.培养基内所含的基本物质,(1)水 (2)碳源 (3)氮源 (4)无机盐,3.培养基内所需的其他条件,(1)pH值 如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性 (2)特殊营养物质- ? 如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素 (3)氧气的含量 如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件,生长因子,(三)无菌技术,1、获得纯净培养物的关键: 2、无菌技术 的四个方面(参看教材20页) 3、消毒与灭菌 (1)消毒： 概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。包括芽孢和孢子吗？ 方法: 煮沸消毒法 巴氏消毒法:如牛奶的消毒 化学药剂消毒:酒精

3、、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等 紫外线消毒,(不包括芽孢和孢子),防止外来杂菌的入侵,（2）灭菌,概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 方法：a 灼烧灭菌 b 干热灭菌 c 高压蒸汽灭菌,灼烧灭菌,微生物的接种工具 (接种环、接种针)或其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧,注意适用范围,干热灭菌 160170 ；12h,能耐高温的需要保持干燥的物品( 玻璃器皿),高压蒸汽灭菌 100kPa 121 15-30min,通常用于培养基的灭菌,二、实验操作,（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 计算称量溶化灭菌倒平板 （二）分离纯化大肠杆菌 接种方法有： 划线分离法和涂布分

4、离法 （三）将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入37恒温箱中培养12h和24h后，观察并记录,三、课题延伸：菌种的保藏,1、斜面保藏 （临时保存） 2、甘油保藏 （长期保存）,实验1：大肠杆菌的培养和分离,设备及用品： 灭菌锅或高压锅、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈、直径90mm的培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有酒精棉球的广口瓶、镊子、有棉塞的试管（15mm120mm）5支 实验材料： (1)50mlLB液体培养基：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、NaCl 0.5g、加水50ml。 (2)大肠杆菌菌种斜面 (3)空白斜面,实验步

5、骤,(1) 灭菌：将配制好的50mlLB液体培养基和50mlLB液体培养基分别装入两个250ml 的三角瓶中，加上封口膜，用高压锅进行灭菌。 (2) 制平板：在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在4个培养皿中，使培养基铺平皿底部，待凝，使之形成平面。 (3)接种扩大培养：靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到三角烧瓶的液体培养基中，三角烧瓶在37摇床振荡培养12h。 (4) 划线分离：将摇床上培养12h的菌液在固体培养基的平板上连续划线，然后将盖好的培养皿倒置，放在37恒温培养箱中进行培养。 (5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在空白斜面上，在37下培养24h, 4冰箱保

6、存。,实验讨论实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？,实验完成后，所有接触过细菌的器皿都必须先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体影响人畜健康，也污染环境，因此必须高压灭菌。使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。对于取样器的取样头，通常是灭菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤纶30 min ,再用清水洗净，仍可再用。封口膜也可再用。,无菌技术的四个方面,（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒 ； （2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌 ； （3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行； （4）避免已灭菌处理的材料用

7、具与周围物品相接触。,(三)无菌技术返回,倒平板,讨论:,(1).培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？ (2).为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ (3).平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ (4).在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的 湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分

8、更好 地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生， 因此最好不要用这个平板培养微生物。,返回,1、平板划线法,讨论:,(1).为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ (2).在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ (3).在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的 微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划 线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上 的

9、菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加， 使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束 后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污 染环境和感染操作者。,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,返回,2.稀释涂布法:,(1)系列稀释操作:,涂布平板操作,讨论:涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。,返回,返回,菌落：,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。 不同的细菌的菌落特征不同 菌落是鉴定菌种的重要依据。,(2)碳源,可作为碳源的物质有: 含碳无机物: 、 、 含碳有机物：,蛋白质,脂肪酸,返回,不同微生物所利