生物化学核酸的合成.ppt

1、核酸的生物合成,第一节 DNA的生物合成 第二节 RNA的生物合成 第三节 基因工程的简介,DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。,中 心 法 则,1964-1970 劳氏肉瘤病毒的 遗传方式 致癌RNA病毒,1958年，遗传信息的单向,中心法则,中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象

2、有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。,中心法则的遗传流向有5条途径 1、DNADNA：DNA复制 （以DNA为模板合成DNA） 2、RNA RNA：RNA复制 （以RNA为模板合成RNA） 3、DNA RNA：DNA转录 （以DNA为模板合成RNA） 4、RNA DNA：反(逆)转录 （以RNA为模板合成DNA） 5、RNA Protein：翻译,复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。 转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA

3、的过程。 翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。 逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。,第一节 DNA的生物合成,一、DNA的半保留复制 二、与DNA复制有关的酶和蛋白质 三、DNA的复制过程 四、逆转录 五、DNA的损伤修复,DNA,双链线状,双链环状,单链线状：动物病毒MVM,单链环状：噬菌体X174,真核细胞染色体DNA,噬菌体T2，T5，T7，P22,E-Coli染色体DNA,线粒体DNA,叶绿体DNA,多瘤病毒DNA，病毒SV40DNA,噬菌体和X174的复制型,回顾DNA的结构特点：,3,5,3,5,一、DNA的半

4、保留复制 定义：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制 （semiconservative replication）,使E.coli在含有唯一氮源15N（15NH4Cl）的培养基中培养，使得细菌的亲代DNA中含有15N ，具有较高的密度。 将生长在15NH4Cl培养基的E.coli转移到含有唯一氮源14N（ 14NH4Cl）培养基中培养。 如果DNA是半保留复制，那么E.coli在含有14N氮源介质中复制一轮后分离出的DNA分子应当是14N和15N各占50的杂化分子（一条15N -DNA链和一条14N -D

5、NA链），分子的密度处于14N和15N之间。进行半保留复制第二轮产生的DNA分子中，有一半不含有15N ，表现出低密度；另一半是14N和15N各占50的杂化DNA分子，表现出中等密度。通过平衡密度梯度离心，不同密度的DNA分子可以按照它们在铯盐中的浮力彼此分开，密度高的DNA分子出现在离心管的低部，密度最低的出现在离心管的上部，中等密度的位于中部。,DNA的半保留复制实验依据,1958年Meselson 然后在DNA旋转酶（TOP)的作用下，使螺旋DNA局部变成松弛态。,起始因子、引物酶、DNA聚合酶等随后结合，,引发体在复制叉上移动，DnaB蛋白活化引物合成酶,引发RNA引物的合成。 领头链

6、先引发开始合成，以原来一条DNA单链为模板（3 5),按5 3的方向合成一段RNA引物链。领头链开始合成后，后随链也开始合成其引物。引物长度约为几个至10个核苷酸，在引物的5端含3个磷酸残基（引物酶的底物是核苷三磷酸），3端为游离的-OH。,（2）RNA引物的合成,领头链(leading strand),后随链(lagging strand),5,3,5,3,在DNA聚合酶的催化下，以四种脱氧核糖核苷5-三磷酸为底物，在RNA引物的3端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。 DNA链的延伸同时进行,领头链和后随链两条链的合成方向相反。,（3）DNA链的延伸,领头链在DNA复制时，合成

7、方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链。 随后链在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链。 半不连续复制在DNA复制时，领头链是连续合成的,而随后链的合成是不连续的，这种复制方式称为半不连续复制。,半不连续复制的发现（1968）： 同位素实验，3H标记dT 短时间内检测为DNA小片段，片段的长度为10002000核苷酸残基，后来称为岗崎片段 一段时间后 检测到 DNA大片段。当用DNA连接酶的变异株时，检测到大量小DNA片段的积累。证明DNA复制中有小片段合成。,冈崎片段（Okazaki fragments） 在DNA复制过程中，领头

8、链能连续合成，而随后链只能是断续的合成53 的多个短片段，这些不连续的小片段以其发现者的名字命名为冈崎片段。 冈崎片段大小： 真核生物：100-200个核苷酸（核小体的DNA单位）。 原核生物：1000-2000个核苷酸（相当于一个顺反子）。,参与链的延伸阶段的蛋白质和酶,均以5/3/方向形成前导链和滞后链,？,当新形成的冈崎片段延长至一定长度，其3-OH端遇到上一个冈崎片段时即停止合成。 前导链合成随复制叉移动到起始点即停止复制（大肠杆菌只有一个起始点）。,（4）复制终止切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段,这时会发生一系列变化：在DNA聚合酶催化下切除RNA引物；留下的空隙由DN

9、A聚合酶催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶作用下，连接相邻的DNA链；修复掺入DNA链的错配碱基。这样以两条亲代DNA链为模板，各自形成一条新的DNA互补链。结果是形成了两个DNA双股螺旋分子。,真核生物中DNA的复制特点,1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。 2、冈崎片段长约100200bp. 3、真核生物DNA复制速度比原核快。 4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制； 5、真核生物有多种DNA聚合酶。 6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，防止染色体间的末端连接。由端粒酶负责新合成链5RNA引物切除后的填补，亦保持端粒的一定长度。,定义

10、:以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA称为逆转录，由逆转录酶催化进行。 1970年Temin和Baltimore同时分别从劳氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分离出逆转录酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有逆转录酶。 用特异抑制物（放线菌素D）能抑制致癌RNA病毒的复制，而对一般RNA病毒的复制无影响。已知放线菌素D专门抑制以DNA为模板的反应，可见致癌RNA病毒的复制过程必然涉及到DNA。所以Temin提出前病毒的假说。,四、逆转录,病毒RNA的逆转录过程 （以前病毒形式引起整合到宿主细胞DNA中而使细胞恶性转化） 单链病毒RNA RNA-DNA杂交分子 双链DNA（

11、前病毒）,逆转录酶也和DNA聚合酶一样，沿53方向合成DNA，并要求短链RNA作引物。,逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性： RNA指导的DNA聚合酶活性 DNA指导的DNA聚合酶活性 核糖核酸酶H的活性，专一水解RNA-DNA杂交 分子中的RNA DNA连接酶，解旋酶的活性,逆转录酶发现的理论和实践意义： 不能把“中心法则”绝对化，遗传信息也可以从RNA传递到DNA。促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，为肿瘤的防治提供了新的线索。目前逆转录酶已经成为研究这些学科的工具。,1983年，发现人类免疫缺陷病毒（human immune deficience virus,HIV）,感染T淋巴

12、细胞后即杀死细胞，造成宿主机体免疫系统损伤，引起艾滋病（ acquired immunodeficiency syndrome,AIDS）,五、 DNA的损伤与修复,1.DNA的损伤 DNA的损伤：DNA在复制时产生错配、病毒基因整合；某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，破坏DNA的双螺旋结构。从而影响DNA的复制，并使DNA的转录和翻译也跟着变化，因而表现出异常的特征（生物突变）。,当DNA受到大剂量紫外线（波长260nm附近）照射时，可引起DNA链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形成二聚体，例如TT二聚体。,2. DNA损伤修复,光复活 切除修复 重组修复 SOS修复,光复活（pho

13、toreactivation）,可见光（最有效波长400nm）激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚体。 是一种高度专一的修复形式，只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚体。,DNA的损伤和切除修复（excision repair）,碱基丢失,碱基缺陷或错配,结构缺陷,切开,核酸内切酶,核酸外切酶,切除,DNA聚合酶,DNA连接酶,AP核酸内切酶,核酸外切酶,切开,切除,修复,连接,糖苷酶,插入酶,碱基取代,重组修复（recombination repair）,又称复制后修复（postreplication repair） 受损伤的DNA在进行复制时，跳过损伤部位，在子

14、代DNA链与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再用合成的多核苷酸来补上母链的空缺，此过程即重复修复。 并非完全校正。,SOS修复,指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，又称倾错性修复（Error-Prone Repair ）。此过程诱导产生切除修复和重组修复中的关键蛋白和酶，同时产生无校对功能的DNA聚合酶。 所以会有2种结果：修复或变异（进化）。,第二节 RNA的生物合成,一、RNA聚合酶 二、RNA的转录过程 三、转录后加工 四、

15、RNA的复制,一、概念 转录的不对称性：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。 反义链（antisense strand）及模板链(template strand) （无意义链，负链）：在RNA的转录中，用作模板的DNA链。 有意义链(sense strand)及编码链(coding strand) 或正链：在RNA的转录中，不作为模板的DNA链。,RNA聚合酶：大肠杆菌的RNA聚合酶全酶由5种亚基2 组成，因子与其它部分的结合不是十分紧密，它易于与2分离，没有、 亚基的酶称为核心酶只催化链的延长，对起始无作用。 五种亚基的功能分别为： 亚基：与启动

16、子结合功能。 亚基：含催化部位，起催化作用，催化形成磷酸二酯键。 亚基：在全酶中存在，功能不清楚。 亚基：与DNA模板结合功能。 亚基：识别起始位点。,一、 RNA聚合酶,真核细胞的RNA聚合酶,酶类,分布,产物,-鹅膏蕈碱 对酶的作用,分子量,反应条件,I,核仁,核质,核质,rRNA 5.8SrRNA 18SrRNA 28SrRNA,mRNA,tRNA 5SrRNA,不抑制,低浓度抑制,高浓度抑制,500 000 700 000,700 000,_,低离子强度,要求Mg2+或Mn2+,高离子强度,高Mn2+浓度,RNA聚合酶的特点：,反应底物-NTP，DNA为模板、Mg2+促进聚合反应。RN

17、A聚合酶不需要引物，合成方向53 。,RNA的转录过程：（以大肠杆菌为例） 起始位点的识别 转录起始 链的延伸 转录终止,二、RNA的转录过程,（1）起始位点的识别,体外实验证明，不含亚基的核心酶会随机地在一个基因的两条链上启动，当有亚基时就会选择正确的起点。 亚基起着识别DNA分子上的起始信号（启动子指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列）的作用。,启动子的结构至少由三部分组成： -35序列提供了RNA聚合酶全酶识别的信号； -10序列是酶的紧密结合位点（富含AT碱基， 利于双链打开）； 第三部分是RNA合成的起始点。,TTGACA,TATAAT,+1 转录起始点,5,3,3,5

18、,35序列,10序列,（2）转录起始,RNA聚合酶全酶扫描解链区，找到起始点，然后结合第一个核苷三磷酸。加入的第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP，很少是CTP，不用UTP。所形成的启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物，第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点， 亚基就会被释放脱离核心酶。,因子仅与起始 有关，RNA的合 成一旦开始， 便被释放,（3）RNA链的延伸,DNA分子和酶分子发生构象的变化，核心酶与DNA结合比较松弛，可沿DNA模板移动，并按模板顺序选择下一个核苷酸，将核苷三磷酸加到生长的RNA链的3-OH端，催化形成磷酸二酯键。转录延伸方向从5 3,（4）转录终止,在DNA分

19、子上（基因末端）提供转录停止信号的DNA序列称为终止子（terminators),它能使RNA聚合酶停止合成RNA并释放出RNA。,需要因子，因子能与RNA聚合酶结合但不是酶的组分，它的作用是阻止RNA聚合酶向前移动，于是转录终止，并释放出已转录完成的RNA链。,不依赖于因子。强终止子序列有两个明显的特征：（ 1 ）在终止点之前具有一段富含G-C的回文区域。（2）富含G-C的区域之后是一连串的dA碱基序列，它们转录的RNA链的末端为一连串U（连续6个）。,依赖因子的终止,发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。,三、RNA的转录后加工 在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录

20、物（primary transcript）往往需要一系列的变化，包括链的裂解、5和3末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的RNA分子。此过程总称为RNA的成熟或称为RNA的转录后加工。,1、mRNA前体的加工： 原核生物的mRNA转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。 真核生物mRNA（半寿期较长）原初转录物很大，在加工过程中形成许多分子大小不等的中间物，它们被称为核内不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA,hnRNA),加工包括： （1）hnRNA被剪接，把内含子（DNA上非编码序列）转录序列剪掉，把外显子（D

21、NA上的编码序列）转录序列拼接上(真核生物一般为不连续基因)。 （2）3端添加polyA “尾巴”； （3）5端连接“帽子”结构（m7G5ppp5NmpNp-）； （4）分子内部的核苷酸甲基化修饰。,2、tRNA前体的加工： 原核与真核生物的tRNA转录后都需要加工。包括： （1）由核酸内切酶切除前体上3和5端上多余的核苷酸； （2）由核酸外切酶逐个在3切去附加序列，进行修剪。 （3）3端添加CCAOH序列，由核苷酰转移酶催化。 （4）核苷的一些特定的碱基和戊糖进行修饰。,酵母酪氨酸tRNA前体的加工,早转录本,成熟tRNA,加工,原核：刚转录的rRNA为30S，先在特定的碱基上进行甲基化（核

22、糖2-羟基）修饰，后逐步裂解（核酸酶的切割）。 真核：45S（哺乳动物）、38S（果蝇）、37S（酵母）,P16,P23,P5,16S,23S,5S（一般不含甲基化）,28S,18S,5.8S,3、 rRNA前体的加工：,45S 或38S,37S,26S 17S 5.8S,rRNA原初 转录物,研究四膜虫rRNA前体的拼接时发现 ribozyme,原核生物中rRNA前体的加工,甲基化作用 专一核酸内切酶,30S前体,17S,tRNA,25S,专一核酸外切酶,16S rRNA,tRNA,23S rRNA,5S rRNA,专一核酸外切酶,真核生物rRNA前体加工,两个阶段 （1）其单链RNA可充当

23、mRNA，利用寄主中的核糖体合成外壳蛋白和复制酶的亚基。 （2）复制酶的亚基可与来自寄主细胞的亚基自动装配成RNA复制酶，可进行RNA的复制.,四、RNA的复制,第三节 基因工程简介,DNA重组与克隆,从细胞中分离出DNA,限制酶截取DNA片断,分离大肠杆菌中的质粒, DNA重组,用重组质粒转化大肠杆菌,培养大肠杆菌克隆大量基因,重组体的筛选,克隆羊多利的诞生,胚胎羊,乳腺上皮细胞（提供DNA）,母羊,除去细胞核的卵母细胞（受体）,体外融合,植入受体母羊,问答题,1、比较DNA复制与RNA转录的异同。 2、比较DNA聚合酶与RNA聚合酶催化作用的异同。 3、DNA复制的高度准确性是通过什么来实现的？ 4、肽链合成后的加工处理主要有哪些方式？ 5、何谓基因工程？简述其基本理论、基本过程及应用价值 名词解释 中心法则 半保留复制 转录 反转录翻译 有意义链反意义链内含子外显子 冈崎片段 突变,1、下列有关TATA盒(Hognessbox)的叙述,哪个是正确的: A.它位于第一个结构基因处B.它和RNA聚合酶结合C.它编码阻遏蛋白D.它和反密码子结合,B,2. 转录需要的原料是: dNTP B. dNDP C. dNMP D. NTP E . NMP,D,